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心肌肥厚(Myocardialhypertrophy,MH)是引起恶性心律失常(Arrhythmia),进而增加心源性猝死(Sudden Cardiac Death,SCD)发生率的主要原因之一。近年来,诸多研究表明,钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)信号通路可以抑制Ca2+释放,致使Ca2+在心肌细胞内潴留,引起心肌组织重构以及心肌细胞电生理的相关变化。Ca2+浓度增加后,同时能够激活心肌细胞过度自噬活动,进一步对心肌造成损伤,从而导致MH的发生,进而发展成心律失常、心力衰竭(心衰,Heart Failure,HF)等疾病,严重者会出现SCD。稳心颗粒(WXKL)是一种抗心律失常的新中药制剂。不少研究也显示,WXKL不仅可以抑制MH、治疗心律失常,还对肥大心肌细胞的电生理变化有着一定的影响。因此,本研究是以过表达CaN蛋白诱导肥大心肌细胞为基础病理模型,利用激光共聚焦显微镜扫描技术,透射电子显微镜扫描技术以及全细胞膜片钳技术进行实验,通过观察CaN蛋白、自噬标志蛋白LC3以及NFATc4蛋白荧光强度、细胞骨架、自噬小体、心肌细胞超微结构以及L型钙电流(ICa-L)的变化,探索在MH的发生发展过程中,CaN信号通路与自噬(Autophagy)的关系,并探究WXKL在其过程中的干预作用,从而为抑制MH,治疗心律失常、HF,降低SCD发生率提供新思路。目的:1.应用激光共聚焦显微镜扫描技术和电子显微镜扫描技术,观察上调/下调CaN蛋白对自噬标志蛋白LC3蛋白荧光强度、心肌细胞骨架大小、细胞自噬小体、心肌细胞超微结构的影响以及应用自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)对CaN蛋白荧光强度的影响,探讨在MH的发生发展过程中,自噬与CaN信号通路的相互关系以及交互作用。2.探究WXKL通过对自噬与CaN信号通路的干预作用,进而研究其治疗MH的主要作用机制。方法:1.将细胞分为 8 组:Control 组、Rapa 组、3-MA 组、SiCaN 组、SiCaN+Rapa 组、OverexpressCaN 组、OverexpressCaN+3-MA 组以及 OverexpressCaN+WXKL 组。加药、染色后,在激光共聚焦显微镜下观察CaN蛋白,LC3蛋白以及NFATc4蛋白的荧光强度以及核转移率的变化。2.实验分为12组:Control组、Rapa组、3-MA 组、WXKL 组、SiCaN 组、SiCaN+Rapa组、SiCaN+3-MA组、SiCaN+WXKL组、OverexpressCaN 组、OverexpressCaN+Rapa组、OverexpressCaN+3-MA组和OverexpressCaN+WXKL组。收集加药处理后的细胞,置于电镜固定液中保存。再进行脱水、包埋、超薄切片,透射电镜观察心肌细胞超微结构,自噬小体等的改变。3.细胞培养以及分组给药方法同前。处理细胞后,应用鬼笔环肽工作液将细胞进行染色,在激光共聚焦显微镜下观察心肌细胞骨架的变化。4.实验分为 4 组:Control 组、OverexpressCaN 组、OverexpressCaN+3-MA 组以及OverexpressCaN+WXKL组,培养和加药方法同前。采用全细胞膜片钳技术,在电压钳制模式下记录ICa-L电流。待膜电容稳定后,记录细胞膜电容,记录ICa-L电流。为消除细胞大小引起的误差,Ⅰ值以电流密度(pA/pF)来表示。结果:1.激光共聚焦测蛋白荧光强度结果:与Control组相比,OverexpressCaN组,LC3、CaN、NFATc4蛋白荧光强度显著增加,且胞核和胞浆中CaN、NFATc4蛋白表达均增加,与正常H9C2细胞经Rapa处理后的效应一致。与Control组相较,SiCaN组,LC3蛋白荧光强度明显下降,CaN、NFATc4蛋白的荧光强度减弱以及核转移率降低;加入Rapa处理后,三种蛋白荧光强度有所增加,且核转移率上升。OverexpressCaN心肌细胞加入5g/LWXKL后,可明显下调LC3蛋白荧光强度升高效应,CaN、NFATc4蛋白荧光强度减弱以及核转移率降低,此作用与OverexpressCaN+3-MA组效应一致。2.上调/下调CaN蛋白表达对自噬小体的作用以及WXKL的干预作用:Control组,线粒体双层膜结构完整,大小、形态正常,内嵴结构完整,溶酶体结构完整,未出现溶解、融合等现象;当加入Rapa后,出现线粒体双层膜结构被破坏,内嵴结构模糊不清,且排列无序。SiCaN组,线粒体外形不规则变化且双层膜结构模糊不清;加入Rapa后,线粒体明显增大,内部出现小空泡结构,内嵴结构出现不完整改变。OverexpressCaN组,线粒体内出现大空泡状结构包裹线粒体,且线粒体肿胀、畸形、嵴断裂或消失,溶酶体形态畸形,且染色变深;经3-MA作用后,线粒体结构有所恢复,内嵴结构有所改善,且空泡消失;经WXKL干预后,线粒体体积明显缩小,且溶酶体颜色变淡。3.激光共聚焦测心肌细胞蛋白骨架结果:Control组心肌细胞的长度和宽度分别是 349.24±56.43 μm 和 125.59±18.74 μm(n=10);与 Control 相比较,经 Rapa 诱导的心肌细胞的长度和宽度均有所增加。OverexpressCaN细胞形态明显肿胀变大,细胞的长度和宽度分别增加到 837.45±57.61μm和 268.83±64.16μm(n=10,P<0.01,vs.Control组,差异有统计学意义);经3-MA以及5 g/LWXKL刺激后,细胞骨架明显减小。4.与Control组进行比较,OverexpressCaN组ICa-L电流幅值明显增加,电流密度在-40 mV到+40 mV的范围内显著增加(n=3,P<0.01,vs.Control组,差异有统计学意义);稳态激活(Steady state activation,SSA)曲线与稳态失活(Steady inactivation,SSI)曲线左移,激活加快,失活减慢,半激活电压(V1/2,act)以及半失活电压(V1/2,inact)减小。经WXKL以及3-MA作用后,电流幅值明显减小,电流密度在-40 mV到+40 mV的范围内减少(n=3,P<0.01,vs.OverexpressCaN组,差异有统计学意义),SSA曲线与SSI曲线右移,V1/2.act以及V1/2,inact增加。结论:1.在心肌细胞发生肥大的过程中,CaN信号通路与自噬存在交互作用。上调CaN蛋白表达会激活异常活跃的自噬活动,下调则会抑制自噬活动。激活自噬活动能够上调CaN蛋白以及NFATc4蛋白荧光强度,增加核转移率;抑制自噬则相反。WXKL能够通过调控CaN信号通路以及心肌细胞自噬活动,抑制MH,从而治疗心律失常。2.说明在上调CaN蛋白后,会激活心肌细胞出现过度自噬,而引起超微结构的破坏以及功能失常,对心肌的能量供应减少,增加心肌耗氧量,破坏心肌结构功能,造成MH。而WXKL能够抑制CaN蛋白上调后引起的心肌细胞组织结构的变化,从而抑制心肌细胞自噬,进而抑制MH的发展,是保护心肌的一条新的途径。3.过表达CaN蛋白后,会触发心肌细胞内自噬活动,从而引起心肌细胞结构变化,骨架增大,弹性减小,细胞收缩力下降,心肌顺应性降低;当抑制自噬后,同时可以反调控CaN信号通路,保护心肌功能。WXKL作用于OverexpressCaN细胞后,细胞骨架改变明显,说明WXKL能够通过调控CaN信号通路,保护心肌功能。4.WXKL与自噬对CaN信号通路都存在调控作用。同时WXKL还能够抑制自噬后,保护心肌细胞线粒体结构与功能,稳定细胞能量代谢和钙稳态,加速钙循环,刺激钙外流,降低细胞内Ca2+浓度,这一作用为WXKL治疗MH,心律失常提供一种新的理论依据,为临床提供一种新思路。