前言 神经组织中的神经丝(neurofilament NF)作为细胞骨架中间丝的一种，是极为复杂和特殊的成分。它与其它中间丝不同，在结构和功能上是与微管密不可分的。构成神经元胞体细胞骨架主体的是微管和神经丝，二者相互缠绕成神经原纤维，而构成轴突主体的只是神经丝。它不仅起支持细胞的作用，决定细胞的形状，还参与一些细胞内和细胞外的运动，如物质运输、能量转换、细胞分化、细胞转化以及细胞器在胞内分布及跨膜信号的传递等一系列重要的生物学过程。其外接质膜，内连核表面和核基质，中间又与微管、微丝及其它细胞器广泛联系，因而在胞质内形成了一个完整的网架系统。 SDS电泳表明神经丝蛋白分为：200KD，160KD，68KD三种，分别称NF-H，NF-M，NF-L。免疫电镜研究三种蛋白的重组表明：P68聚合成主干，P200与P160则在P68构成的主干上呈螺旋状攀绕，并形成中间架桥的侧突。从发育神经生物学角度上看，NF-L与NF-M首先在周围神经和中枢神经系统的神经元中出现，以后NF-H才逐渐出现，是神经元成熟的标志。此时NF-H在相临的NF之间或NF与微管之间形成横桥，使轴突的结构变的更稳定。因NF卫对神经元具有代表性，故本实验主要侧重于对NF旧的研究。 神经元中线状溶酶体（ematolysosome NLY）的存在与神经元的功能有着密切的关联。轴突内不能合成的所需物质，可以通过溶酶体及其前体实现轴浆运输。有关线状溶酶体与神经丝的关系目前还不清楚，对于神经丝功能的了解也还处于摸索阶段。 传统的观点认为NLY与微管有关，与中间丝无关。这是因为应用微管解聚药后，溶酶体的分布发生了变化，殊不知由于中间丝的构建对微管有依赖作用，解聚药同时也破坏了中间丝的结构，已有人证实应用秋水仙素后中间丝的结构发生了明显的变化。 为了证实神经丝的确对NLY的形状与分布有影响，采用优先解聚神经丝的药物一钒酸盐。钒酸盐是一种小分子，容易通透细胞膜，低浓度的钒酸盐被认为是具有模拟胰岛素的第二类作用，也是酪氨酸磷酸酶（IyTtn ase）的抑制剂，它可以使神经丝过度磷酸化，降解为小分子，破坏其整体结构。 本实验主要采用神经细胞培养方法观察神经丝蛋白NFA从发育初期到成熟期间表达量的变化，以NFA的分布代表神经丝的分布，观察应用钒酸盐破坏神经丝的网络样结构及引发的线状溶酶体形状与分布的改变，推测NF0的磷酸化、神经丝的解聚。胞浆钙离子及物质、信号传递的关系与机制。 目前有关神经丝的研究主要集中在蛋白三维重建山NA模型及基因结构等方面，对于其功能的研究尚处于猜想和推测阶段。如果证实神经丝的完整性对于神经元的物质运输，特别是关于线状溶酶体的轴浆转运起着不可缺少的作用，对于研究人类神经系统退行性病变都将有所启示。 ·2· 材料与方法 1．神经丝蛋白NF－H的发育特性： 细胞培养：健康WSfor大鼠新生鼠，出生1天，由中国医科大学实验动物部提供。断颈处死，取出脊髓，用DMEM培养基（含10％胎牛血清＊ 青霉素＊ 牙Inl链霉素＊ HEPES）培养。调整细胞密度为 10 X 10’M毫升，接种于涂有鼠尾胶的盖玻片或聚苯乙烯薄膜上，置于含有 5％CO。的孵箱中，37℃下分别培养至五、七、九、十一、十三天。免疫组化：将盖玻片用 Hank k液漂洗，冷丙酮固定 5分钟，1％Titon X－100作用 10分钟。漂洗后用正常血清封闭液室温作用20分钟。将抗小鼠单克隆抗体200（NTh00）稀释成 1：300，4℃作用过夜，对照组以朋S代替一抗孵育，用生物素标记的二抗室温作用60分钟，再用0．02MPBS漂洗，SABC室温作用60分钟，漂洗。DAB扦p。作用10分钟，封片，镜检，作图像分析定量测定，观察不同培养天数的神经元中NF0的表达量是否有差异。在体脊髓切片取Wistar大鼠脊髓，用冰冻切片机将组织块切成15卜M厚的切片，以冷丙酮固定15分钟，二阮Tntm X－100作用 10分钟。漂洗后用 3％HZO。室温作用 10分钟，正常血清封闭液室温作用10分钟，其余操作同上。作图象分析，以提供参考值。 2．钒酸盐对NF卫的影响及5！发NLY的改变： 将培养十一天的脊髓神经元随机分成四组／组：正常组人组：力人10kM 正钒酸钠（调节PH为7．2），50pl／子，12小时＊组：加人上述正钒酸钠，50ptr孔＊ 小时后换成正常培养基培养12小时刀组：加人上述正钒酸钠，50pL／孔，24小时。 免疫细胞化学操作及电镜技术：免疫荧光法一将盖玻片用冷丙酮固定5分钟，漂洗后用正常血清封闭液室温作用10分钟。将 ·3·抗小鼠单克隆抗体 200（NTh00）稀释成 1：300，4℃作用过夜，对照组以＊鹏代替一抗孵育，S＊SC h抗以1：10o稀释，37℃孵育2 ／J’时，再加人 SABCCy3（稀释成 1：1皿L4℃暗箱作用 60分钟，用 0．02MPBS漂洗约30分钟。以 PBS封固，荧光显微镜检测免疫组化结果。SABC免疫细胞化学反应一光镜操作同上。电镜操作将聚苯?