本文从以下几个方面进行论述：　　第一部分 原发性干燥综合征B细胞差异表达基因研究　　目的：　　原发性干燥综合征（Primary Sj(o)grens syndrome，pSS）是一种主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫性疾病。临床除有涎腺和泪腺受损、出现口干、眼干外，尚可累及肾脏、肺、外周和中枢神经系统。pSS的具体发病机制未明，突出的免疫学特点是B细胞异常活化，外周血及唇腺组织中B细胞比例明显增多，并可在唇腺组织中形成异位生发中心，异常活化的B细胞导致高免疫球蛋白血症和大量自身抗体的产生，大约有5％的患者最终进展成淋巴瘤。　　近年来二代测序技术发展迅速(Next-generation sequencing, NGS)，RNA-seq技术可全面快速地获得特定组织或细胞在某一状态下的几乎所有转录本信息。转录组研究可以对特定组织或细胞中的基因定量分析和定性研究，对不同组织间的差异表达基因结构等进行研究。本研究的目的是通过对pSS患者和健康对照外周血B细胞进行转录组测序，从而发现差异表达的基因。　　方法：　　本实验入组北京协和医院风湿免疫科门诊就诊的pSS3例，同时入组性别年龄匹配的健康志愿者3例。分离外周血单个核细胞，利用磁珠分选得到CD19+B细胞，提取B细胞总RNA，构建转录组测序所需的cDNA文库，利用RNA-seq技术进行测序。通过比对分析，筛选出pSS患者和HC间差异表达基因，利GO注释和KEGG pathway进行富集，分析这些差异表达基因可能的生物学功能。所有入组的pSS患者均符合2002年欧美共识小组(AECG) pSS国际分类标准和2012年美国风湿病学协会(ACR) pSS诊断标准。　　结果：　　1、转录组分析中，将pSS患者和HC的B细胞样本进行比对分析，共筛选出51个差异表达上调基因和22个差异表达下调基因。差异表达上调基因主要包括IFI44L、IFI44、IFIT1、IFITM1、IFIT3、IFIT2、IRF7、IFI6、ISG15等一系列IFN相关基因。　　2、进行GO注释分析发现这些差异表达基因显著富集于与IFN相关信号通路及其调节通路上，进行KEGG pathway分析发现，这些基因多集中于微生物感染相关的信号通路上，如流感病毒A、丙型肝炎病毒、麻疹病毒和单纯疱疹病毒感染等途径上。　　3、表达上调的基因除了干扰素相关的基因外，比较重要的有ZNF683和EPSTI1，ZNF683在胸腺和周围T细胞、NKT细胞的分化中起着重要作用。EPSTI1可以通过促进Stat1和p65的入核和磷酸化促进巨噬细胞炎症相关基因的表达。　　4、差异表达下调的基因中，比较关键的基因包括ESR2和EGR1，其中ESR2为雌激素受体，EGR1具有抑制细胞生长转化、促进凋亡的作用。　　结论：　　在pSS患者外周血B细胞中筛选出51个差异表达上调和22个差异表达下调的基因。这些上调差异表达基因主要集中于IFN相关信号通路及病毒感染有关通路上。有可能是外界病毒等微生物感染触发了IFN信号通路的级联反应，最终导致B细胞的活化增殖。　　第二部分 EPSTI1促进原发性干燥综合征B细胞异常活化的机制研究　　目的：　　pSS是一种常见的自身免疫性疾病，近年来越来越多的证据表明B细胞在pSS发病机制中起着核心作用。pSS突出的免疫学特点是B细胞异常活化，产生过多的免疫球蛋白和多种自体抗体。通过转录组测序，我们在pSSB细胞中共筛选出51个差异表达上调基因和22个差异表达下调基因。进行GO注释分析发现这些差异表达基因显著富集于显著富集于与IFN相关信号通路及其调节通路上，进行KEGG pathway分析发现，这些基因多集中于微生物感染相关的信号通路上，如流感病毒A、丙型肝炎病毒、麻疹病毒和单纯疱疹病毒感染等途径上。　　IFN-α和IFN-γ可促进BAFF的分泌，导致B细胞和T细胞的活化，IFN相关基因已经被广泛研究，因此我们想研究IFN相关基因之外的差异表达基因，EPSTI1进入我们的视线，EPSTI1是上皮间质相互作用蛋白1，在一些恶性肿瘤（如乳腺癌）中可以促进癌细胞的转移和生长，之前的研究在pSS外周血PBMC中也发现了EPSTI1表达的上调，最新的一篇小鼠模型研究中发现，小鼠骨髓来源的巨噬细胞EPSTI1可以通过促进Stat1和p65的入核和磷酸化促进巨噬细胞炎症相关基因的表达。本课题研究EPSTI1对B细胞功能的影响，以期对pSSB细胞异常活化的机制作出初步阐述。　　方法：　　本实验入组北京协和医院风湿免疫科门诊就诊的pSS40例，同时入组性别年龄匹配的健康志愿者40例。分离外周血单个核细胞，利用磁珠分选CD19+B细胞，提取B细胞总RNA，荧光定量PCR检测EPSTI1表达水平;提取B细胞总蛋白，免疫印记法检测EPSTIT1的蛋白表达水平;在IL4+Anti-IgM+CD40L和CpG+CD40L刺激条件下，在B细胞化学转染siRNA，沉默EPSTI1的表达，用CCK8法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，收集上清，ELISA检测免疫球蛋白水平;沉默EPSTI1的表达后，免疫印记法检测下游通路的蛋白表达水平。所有入组的pSS患者均符合2002年欧美共识小组(AECG) pSS国际分类标准和2012年美国风湿病学协会(ACR) pSS诊断标准。　　结果：　　1、pSS患者外周血B细胞EPSTI1 RNA相对表达量为(1.596±0.1821)，较HC(0.9312±0.0895)显著升高(p=0.0024)。pSS外周血B细胞中EPSTI1的蛋白表达水平较HC明显升高，经ImageJ灰度量化分析后，pSS相对值为(1.768±0.1714)，较健康对照(1.000±0.0119)显著升高，差异具有统计学差异（p=0.0042）。　　2、在IL4+Anti-IgM+CD40L刺激条件下，siRNA组B细胞增殖的细胞数为(374800±34310)，较对照siRNA组(435700±38130)虽有下降趋势，但差异无统计学差异(p=0.2626)。在CpG+CD40L刺激条件下，siRNA组B细胞增殖的细胞数为(404900±17220)，较对照siRNA组(652400±23560)显著减少(p＜0.0001)。　　3、无论在CpG+CD40或者IL4+Anti-IgM+CD40L刺激下，Blank组、siRNA组、对照siRNA组B细胞早期凋亡、晚期凋亡比例均无显著差异。　　4、在CpG+CD40L刺激下，siRNA组B细胞分泌IgG浓度为(611.4±46.76) ng/ml，较对照siRNA组IgG浓度(1026±79.42) ng/ml显著减少(p=0.0011)。siRNA组IgA较对照siRNA组IgA浓度无统计学差异(p=0.7299)。siRNA组IgM浓度较对照siRNA组IgM浓度无统计学差异(p=0.4578)。IL4+Anti-IgM+CD40L刺激下，siRNA组IgG、IgA、IgM较对照siRNA组均无显著差异。　　5、在B细胞系Ramous细胞和Raji细胞分别转染siRNA72 h后，siRNA组和对照siRNA组总的p65水平相同，但siRNA组磷酸化的p65水平较对照siRNA组明显降低，且siRNA组磷酸化的p65水平在无CpG刺激情况下水平较低，随着CpG的刺激磷酸化水平逐渐增加，在CpG刺激30 min后达到峰值，45 min后略有下降。而siRNA组和对照siRNA组磷酸化的p38和磷酸化的JNK水平大致相同。　　6、人原代B细胞转染siRNA72 h后，siRNA组和对照siRNA组总的p65水平相同，但siRNA组磷酸化的p65水平较对照siRNA组明显降低，且siRNA组磷酸化的p65水平在无CpG刺激情况下水平较低，随着CpG的刺激磷酸化水平逐渐增加，在CpG刺激20min和30 min后达到峰值，45 min后略有下降。而siRNA组和对照siRNA组磷酸化的p38和磷酸化的JNK水平大致相同。　　7、pSS患者外周血B细胞中磷酸化的P65相对值为(1.800±0.1080)，较HC(1.000±0.0913)显著升高，差异具有统计学差异(p=0.0013)，pSS患者外周血B细胞中总IκBa相对值为(0.5500±0.0646)，较HC(1.075±0.0629)显著降低，差异具有统计学差异(p=0.0011)。　　8、在Ramous细胞系中，通过转染siRNA沉默EPSTI1后，siRNA组总IκBα相对值为(1.580±0.1772)，较对照siRNA组(0.5800±0.2010)显著升高，差异具有统计学差异(p=0.0203)。在原代B细胞系中观察到同样的现象，siRNA组总IκBα相对值为(1.660±0.0510)，较对照siRNA组(1.000±0.0447)显著升高，差异具有统计学差异(p＜0.0010)。　　结论：　　pSS患者外周血B细胞EPSTI1水平表达上调，EPSTI1通过TLR9通路促进IκBa的降解，引起p65的磷酸化，从而促进B细胞的增殖和免疫球蛋白的分泌。