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毛白杨是我国特有的乡土树种,分布面积广,具有栽培容易、早期速生、无性繁殖容易等优点,备受林木育种学家的重视。热精胺合酶基因(ACL5)在植物维管发育等方面发挥着重要作用。枣是第一大经济林树种,但缺乏稳定的分子标记。为此,本论文进行了如下两项研究:
一、毛白杨热精胺合酶基因的克隆和初步功能分析
从毛白杨cDNA中分离出ACL5基因cDNA,构建了植物表达载体pBI121-CaMV35S-senseACL5,然后利用农杆菌介导法将毛白杨ACL5基因转入普通烟草中,采用实时荧光定量PCR方法检测了转基因烟草植株中外源ACL5基因的相对表达情况,得到了基因表达量高的L7转基因烟草植株,其表达量为参比基因ACTIN的2.391倍。在初步探讨ACL5基因功能中,分析植株生长高度时发现,表达量高的L7植株平均高度高于其他株系,并且与非转基因植株差异极显著:耐盐性分析发现外源ACL5表达量低的转基因烟草L4可以在200mM的NaCl胁迫下正常生长,而其他株系则表现出生长不良的现象。利用农杆菌介导法将ACL5基因在毛白杨中进行了过表达研究,成功获得了过表达ACL5基因的毛白杨植株并进一步测定了转基因毛白杨中ACL5基因相对表达量,其中01转基因毛白杨中ACL5基因的表达量最高,是野生型毛白杨的3.004倍,为今后转基因植株的生长发育性状、抗逆性分析提供了材料。
二、冬枣微卫星富集文库构建
以冬枣基因组为材料,先进行内切酶消化,然后以生物素标记的(AC)15和(AG)l5为探针进行杂交,借助磁珠固定筛选出含微卫星片段,构建了富集相应微卫星的6个文库。从文库共得到6720个克隆,PCR筛选鉴定出2446个含微卫星位点的克隆,测序后获得了2030个高质量序列,其中含微卫星的克隆有1854个(91.3%);排除冗余序列后得到1488个含微卫星位点的非同源性克隆,共含有2649个微卫星位点。除含有高比例的二核苷酸重复外,还发现了四核苷酸重复及六核苷酸重复。选取12个合适微卫星位点设计12对引物,在6个不同的枣品种中进行多态性检测,结果表明多态性明显,表明富集文库构建成功。所开发的SSR标记将在枣的遗传育种研究中发挥重要作用。