乳房炎是一种常见的奶牛疾病,也是造成当今世界奶牛业损失巨大的疾病之一。由革兰氏阴性菌大肠杆菌引起的乳房炎是很普遍的,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是大肠杆菌细胞壁外膜中的重要组成部分。Toll样受体4(Toll-like receptor4, TLR4)是天然免疫系统识别病原微生物的主要受体,在天然免疫反应中具有重要的作用,TLR4与革兰氏阴性菌引起的乳房炎密切相关,已经成为很多国内外学者的研究热点。TLR4介导LPS引起的免疫应答,它识别LPS的保守结构并产生应答,并激活转录因子NF-κB,增强炎性细胞因子表达。本试验用LPS处理,通过体内、体外试验,观察小鼠乳腺组织中TLR4表达的变化,以及炎性细胞因子之一TNF-α的表达变化,并对其结果进行讨论。1LPS对小鼠乳腺组织中TLR4和TNF-α mRNA表达的影响选取40只雌性ICR小鼠,受孕后随机分为是试验组和对照组。雌鼠生产第10～11天,试验组经第四对乳头灌注20μg/mL LPS0.1mL;对照组灌注0.1mL生理盐水,分别于灌注后1.5h、3h、6h、12h采集样本,乳腺组织做石蜡切片,HE染色进行组织学观察；提取乳腺组织总RNA,利用RT-PCR法,检测各组乳腺组织中TLR4和TNF-α mRNA表达。组织学结果表明灌注1.5h后乳腺组织中有少量炎性细胞浸润,6h、12h乳腺腺泡内有大量的炎性细胞浸润,腺泡结构崩解；对各组中TLR4和TNF-α的mRNA表达水平进行分析时,发现灌注LPS能够增强TLR4和TNF-α mRNA表达,6h TLR4mRNA表达极显著高于对照组(P<0.01)；四个试验组中TNF-α mRNA表达极显著高于对照组(P<0.01)。2乳腺上皮细胞培养方法的建立取妊娠14～19天的ICR,小鼠第四对乳腺,用胶原酶消化法进行原代乳腺上皮细胞培养。观察细胞形态,用MTT法绘制生长曲线确定细胞的对数生长期。细胞培养24h大部分细胞团贴壁；48h细胞从团块伸展出来,乳腺细胞体积增大；72h细胞呈典型的立方上皮形态,细胞之间紧密接触；96h细胞融合80%-90%;120h细胞生长停止。从绘制的生长曲线可以看出细胞生长状态良好,符合细胞的一般生长规律。3LPS对小鼠乳腺上皮细胞中TLR4和TNF-α mRNA表达的影响培养原代乳腺上皮细胞,对数生长期的细胞融合至80%～90%时,吸去培养基,用PBS洗两次,将细胞分为四个试验组和一个对照组,每组三个重复孔,试验组加入2mL LPS (1μg/mL);对照组加入2mL DMEM-F12培养液,放入培养箱,分别于1.5h、3h、6h、12h收集细胞提取RNA,利用RT-PCR法检测各组TLR4和TNF-α的nRNA表达水平,试验重复三次。PCR扩增结果表明LPS刺激后TLR4和TNF-α mRNA表达增强,1.5h、3h、6h组TLR4mRNA表达显著高于对照组(P<0.05),1.5h TNF-α mRNA表达显著高于对照组(P<0.05)