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目的 慢性HBV感染是我国的常见病，迄今尚无满意疗法。基因治疗是抗病毒治疗研究的热点，获得高效靶向性导入载体是基因治疗的关键。HBV具有天然嗜肝特性，能在肝细胞内持续复制，反复感染，病毒本身对细胞无明显细胞毒性。HBV具有作为肝靶向性基因治疗载体的基本条件，与其它病毒载体相比，理论上具有明显优势：它可以利用乙肝患者这个天然“包装细胞”，将目的基因的嗜肝性及抗HBV作用在慢性HBV感染者体内长期保持及放大；当HBV复制水平下降时，重组HBV也将随之减少或消失，有可能从根本上克服目前治疗载体的缺陷。本课题对HBV基因组作了三种类型改造：(1)构建C基因截短型HBV载体；(2)构建包膜蛋白突变的HBV载体；(3)构建核心蛋白和包膜蛋白联合突变HBV载体，在细胞和分子水平上观察它们的抗HBV作用，同时探讨adw亚型C基因截短型HBV载体在ayw亚型缺失包装信号辅助质粒辅助下的复制和包装。 方法 1、以野生型HBV质粒adwR9为骨架，构建C基因截短型、野生型C基因真核表达载体pcDNA3-△C(缺失核心蛋白的118-183aa)、pcDNA3-C和C基因截短型HBV载体pHBV-△C(缺失2256-2299nt)。应用脂质体分别将pcDNA3-△C和pcDNA3-C转染HepG2细胞，48小时后提取胞内蛋白，采用Western blot检测蛋白表达。将pcDNA3和pcDNA3-△C分别与adwR9共转染HepG2细胞，采用荧光定量PCR检则培养上清和胞内病毒量，采用ELISA方法检测培养上清中S抗原。将pcDNA3-C分别与pcDNA3-△C和pcDNA3共转染HepG2细胞，采用Native Western blot检测胞内核心颗粒形成。应用脂质体将pHBV-△C单独转染HepG2细胞，以adwR9转染HepG2细胞为对照，采用ELISA方法定量分析胞内和上清中S蛋白表达量和分泌量，采用Western blot检测胞内S蛋白表达。将pHBV-△C与adwR9共转染HepG2细胞，以pcDNA3与adwR9共转染HepG2细胞为对照，采用荧光定量PCR检测培养上清和胞内病毒量。 2、以野生型HBV质粒adwR9为骨架，通过定点突变构建包膜蛋白突变HBV第三军医大学博士学位论文载体pHBV一msl(presl区梭基端的1 3aa中，pro和leu密码子突变成^rg)、pHBV一ms(5 looP56一59aap*LT*15*FN*乏;)和pHBV一mslS。在此基础上，构建S基因突变型和野生型S基因真核表达载体pcDNA3一ms和pcDNA3一s。应用脂质体将peDNA3一ms和peDNA3一S分另!转染HepGZ细胞，采用ELIsA方法检测培养上清和胞内S抗原，采用West。m blot检测胞内蛋白的表达。将peDNA3一ms和peDNA3分别与adwRg共转染HepGZ细胞，采用ELIsA方法检测培养上清S抗原，采用荧光定量P〔R检测培养上清和胞内病毒量。将pHBV一msl、pHBV一ms、pHBV一ms 15和a，lwRg分别转染HepGZ细胞，采用ELISA方法定量分析胞内S蛋白表达量和上清中S蛋白分泌量，采用荧光定量PCR检测培养上清和胞内病毒量。应用脂质体将pHBv一ms 15和adwRg共转染HepGZ细胞，以peDNA3与adwRg岁三转染HepGZ细胞为对照，采用荧光定量PCR检测培养上清和胞内病毒量。3、构建核心蛋白和包膜蛋白联合突变HBv载体pHBv一ms 15/△C。应用脂质体将该载体和pHBv一△C分别与adwRg共转染HePGZ细胞，采用荧光定量PCR检测培养上清和胞内病毒量。pHBv一△〔与辅助质粒pHBv3 1 42共转染HepGZ细胞，以pHBV一△C与pGEM共转染HepGZ细胞为对照，采用pCR检测细胞核内eceDNA和上清中rcnNA形成;采用Native Western blot检测C蛋白颗粒形成，采用Southern blot检测C蛋白包裹的DNA。 结果1、pcDNA3一C表达的蛋白分子量与野生型adwRg表达的C蛋白分子量一致，pcDNA3一△C表达的蛋白分子量较野生型adwRg表达的C蛋白分子量小，表明重组载体能在HepGZ细胞中稳定表达目的蛋白。pcDNA3一△C与adwRg共转染细胞的上清及胞内病毒量分别为1 .327 x lo4eopieszml和4.93oXlo4eopies/ml，而peDNA3与adwRg共转染细胞的上清及胞内病毒量分别为6.13oxlo3eopies/ml和l.s29X108。o:，ies/ml。两组培养上清中s抗原差异无显著性(P>0.05)。这表明单基因C突变体具有抗HBV作用，但不影响s蛋白的表达。pcDNA3一C和PcDNA3一△C共转染细胞的胞内核心颗粒条带较peDNA3一C和peDNA3共转染组条带淡，peDNA3一△C和peDNA3共转染组无条带，提示突变C蛋白不能形成核心颗粒，但可与野生型C蛋白相互作用，干扰核心颗粒形成。pHBV一△C转染细胞的胞内S蛋白量与adwRg转染细胞的基本相同，无显著差异性(P>0.05;pHBv一△C和adwRg共转染细胞的胞内和上清中病毒量分别为8.977xlo7心opies/ml和9.069X107eopies/ml，第二军医大学博士学位论文而adwRg和pcDNA共转染细胞的胞内和[清中病毒量分别为2.379Xlogcopies/ml和2.43 x logeopies/ml。这表明HI;ve基因截短对S蛋白的表达无影响，但可干扰HBV病毒复制。2、pcDNA3一ms表达的突变S蛋白分子量和野生型S蛋白的分子量一致，约为27KD，突变体转染细胞胞内和上清中S蛋匀量与野生型adwRg转染细胞中的基本相同，无显著性差异(P>0.05)。pcDNA3一ms与adwRg共转染细胞的上清中和胞内病毒量分别为2.43 zx一oZcopi‘:s/ml和9.034火logeopies/ml，而pcDNA3与adwRg共转染细胞的上清中和胞内病毒量分别为1 .344X1 o4eop