研究背景由于创伤、感染、骨肿瘤以及发育异常等原因造成的骨缺损,特别是复杂解剖结构的骨缺损一直是困扰临床的一大难题。目前,对于骨缺损的治疗主要采用自体骨移植和异体骨移植。然而,自体骨供应来源有限,并能造成供骨部位的残留疼痛和变形；异体骨具有抗原性,存在感染疾病的风险,而且自体骨和异体骨,很难制造出与骨缺损形态相匹配的外形轮廓。20世纪80年代出现的骨组织工程学技术为骨缺损,特别是复杂结构的骨缺损的修复开辟了新的渠道。支架是骨组织工程的关键要素之一,理想的支架材料不但要具有良好的机械强度和生物活性,而且要具备能够提供细胞和新生组织长入的合理三维空间结构,以及与缺损部位相匹配的复杂外形。虽然传统的支架制造方法(纤维黏结、相分离、溶剂浇铸/微粒过滤、膜迭片法、融化成形、气体发泡/微粒过滤法以及这几种方法的并用)应用已经十分广泛,但存在致命缺点,主要表现为制造过程人工操作,使用有毒的有机溶剂,缺乏对孔结构(如孔的尺寸、空间走向、连通性等)的控制,很难制造出与骨骼相匹配的外形轮廓。20世纪80年代出现的一种基于计算机辅助设计(Computer aided design, CAD)的新型制造技术——快速成形(Rapid prototyping, RP)技术,可以制造任意复杂形状的三维实体,为骨组织工程支架的仿形与仿生制造提供了可能。本研究组自1995年,用“热液交换反应法”将滨珊瑚改造合成为珊瑚羟基磷灰石(Coralline hydroxyapatite, CHA),并且证明生物相容性良好,其天然的微孔样结构与人的松质骨结构极其相似,有利于纤维及血管组织长入,但CHA人工骨脆性较大,无法根据骨缺损的形状个性化地制备出人工骨支架,存在一定不足。如果能够利用快速成形技术,在保留珊瑚羟基磷灰石的天然微孔样结构的基础上,根据骨缺损的形态,利用数字骨科相关技术,个性化地制备出人工骨支架修复材料,这样可以避免支架制备过程中二期制孔的繁琐工艺,这将极大地促进骨组织工程支架的发展。具有生物相容性和可降解性的高分子生物材料为数字化珊瑚羟基磷灰石(Digital coralline hydroxyapatite, DCHA)人工骨支架材料的制备提供了关键“附形剂”。左旋-聚乳酸(L- polylactic acid, L-PLA)是一种已在医学上广泛应用的人工合成的高分子材料,作为人体的植入物已经通过美国食品药品管理局的认证,并已被广泛用于内固定装置例如骨板、骨钉、手术缝合线、纺丝等。本研究将选用L-PLA作为“附形剂”,将珊瑚羟基磷灰石制备成DCHA人工骨支架材料,通过系列实验,研究DCHA人工骨支架材料的理化学特性、生物相容性,通过修复动物骨缺损模型,探讨其临床应用的可行性。研究目的1.研究DCHA人工骨支架材料的制备方法,并对其结构特征及物理、化学性能进行分析,探索制备DCHA人工骨支架材料的原料的理想配比。2.研究DCHA人工骨支架材料在体外模拟体液条件下降解性能,探讨其作为组织工程材料的可行性。3.对DCHA人工骨支架材料进行细胞毒性试验、溶血反应、热原试验、急性毒性试验、迟发性超敏反应试验,以评价DCHA人工骨支架材料生物安全性,为进一步研究提供实验依据。4.通过体外分离培养兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)并向成骨方向诱导培养,将成骨诱导的细胞与DCHA人工骨支架材料进行体外复合培养,检测DCHA人工骨支架材料的细胞相容性。5.探索DCHA人工骨支架材料的成骨作用及作为骨替代材料的可行性,期望为临床治疗骨缺损提供新的人工骨材料。研究方法1.将珊瑚羟基磷灰石粉碎成250μm-500μm微粒,然后将其与L-PLA以不同的质量比(2：1、3：1、4：1、5：1)混合均匀后,采用Simpleware 3.1软件,通过CAD构建一数字化的圆柱形模型,通过数控转换,将其生成STL格式的文件,导入快速成型机,采用选择性激光烧结快速成型的工艺,将数字化的模型制备成不同质量比的DCHA人工骨支架材料。采用游标卡尺测量制备的DCHA人工骨支架材料的高度和直径,将其与CAD模型的高度和直径进行对比分析,评价不同质量比制备的DCHA人工骨支架材料的精确度。通过模拟体液浸泡检测不同质量比制备的DCHA人工骨支架材料的亲水率。采用压汞仪、材料力学试验机和扫描电镜等对不同质量比制备的DCHA人工骨支架材料的的理化、结构和力学性能进行对比分析。2.将采用质量比为3：1和4：1的CHA微粒与L-PLA为原料,制备的DCHA人工骨支架材料试件,分别放置于初始pH值为7.4的50mL模拟体液(stimulated body fluid, SBF)中,在37℃恒温箱中降解,观察各试件的大体形态、颜色及光泽等变化。并分别于2W、4W、8W、12W、16W检测其在模拟体液中的PH值,钙、磷离子浓度变化情况,并检测各试件材料在不同时间点的材料降解率、抗压强度变化。采用扫描电子显微镜观察降解16W时DCHA人工骨支架材料的微观结构变化。3.参照GB/T 16886.1-2001 idt ISO 10993-1：1997和GB/T 16175 -2008,对采用质量比为3：1和4：1的CHA微粒与L-PLA为原料,制备的DCHA人工骨支架材料试件,进行细胞毒性实验、溶血反应、热原实验、急性毒性实验、迟发性超敏反应实验的生物学评价。3.1细胞毒性实验：采用体外细胞培养技术,观察DCHA人工骨支架材料浸提液对L-929细胞形态的变化,采用MTS法检测对L-929细胞增殖情况的影响,以评价其细胞毒性。3.2溶血反应：检测DCHA人工骨支架材料浸提液的溶血率,评价材料的溶血反应。3.3热原实验：静脉注射DCHA人工骨支架材料浸提液,观察兔体温的变化,评价材料的热原反应。3.4急性毒性实验：静脉注射DCHA人工骨支架材料的浸提液,观察小鼠的毒性反应,评价材料的毒性。3.5迟发性超敏反应实验：皮内注射DCHA人工骨支架材料浸提液,观察豚鼠皮肤反应情况,评价材料的致敏反应。4.细胞相容性评价4.1兔BMSCs的分离培养、成骨诱导及鉴定抽取新西兰白兔的骨髓5mL,通过密度梯度离心法与贴壁细胞分离法相结合的方法获取BMSCs,体外贴壁培养、扩增、传代,倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态及生长情况,描绘生长曲线。第3代细胞用含1×10-8mol/L地塞米松,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,0.2mmol/L L-抗坏血酸的条件培养液将其定向成骨诱导培养、扩增。采用倒置显微镜观察细胞形态变化,采用MTS法测定细胞增殖情况,采用碱性磷酸酶活性测定、Von Kossa钙结节染色和茜素红染色等方法,鉴定其成骨性能。4.2成骨诱导细胞与DCHA人工骨支架材料体外复合培养将兔BMSCs体外成骨诱导至第3代,接种到预湿的采用质量比为3：1或4：1的CHA微粒与L-PLA为原料,制备的DCHA人工骨支架材料试件上复合培养,采用盖玻片作为阴性对照组。通过倒置显微镜、扫描电镜观察成骨诱导细胞在材料中的生长情况。以MTS法检测材料对细胞增殖活性的影响,以碱性磷酸酶活性测定评价其成骨能力,评价DCHA人工骨支架材料的细胞相容性。5.构建5mm×15mm胫骨干骺端的腔隙性骨缺损,然后采用以质量比为3：1和4：1的CHA微粒与L-PLA为原料,制备的DCHA人工骨支架材料修复骨缺损,空白对照组骨缺损区不植入任何材料。于术后第2天,第4周、8周、12周行X线摄片,观察骨缺损修复及骨塑形情况。参照Lane-Sandhu X线评分标准对各组桡骨缺损的骨修复程度评分。标本行HE染色组织学观察,按照Lane-Sandhu组织学评分法比较各组动物的骨修复情况。结果1.对不同的质量比混合均匀的CHA微粒与左旋聚乳酸混合物,采用CAD和选择性激光快速成型的工艺,可以制备出DCHA人工骨,制备的人工骨支架表面粗糙,呈规整的小圆柱体状,粗细均匀,且随着CHA含量的增加,人工骨支架表面的粗糙度增加,表面的CHA微粒也容易拨脱。本工艺制备的DCHA人工骨支架的加工精度为+0.1cm；制备的不同质量比的DCHA人工骨支架的亲水率为35.00%-53.07%；孔隙率为31.93%～55.36%,密度为1.61g/mm3～2.29g/mm3；抗压强度为1.04MPa-3.70MPa。随着CHA含量的增多,亲水率、孔隙率和密度逐渐增加,抗压强度逐渐降低,各质量间有显著性差异(P<0.01)；制备的数字化人工骨均具备微孔样结构,孔与孔之间纵横交错,孔径为150μm-350μm,随CHA含量的增多,大孔径所占的比例逐渐增多。2.随着体外降解时间的延长,DCHA人工骨支架材料表面粗糙度逐渐增加,有细颗粒样材料溶出,孔隙增大。在16周的降解过程中,pH值略有降低,pH值维持7.34-7.36,同一时间点的pH值均高于L-PLA降解液的pH值(P<0.01),低于HA降解液的pH值(P<0.01)。钙、磷离子浓度随降解时间延长逐渐增高,开始2周内升高较快；第4W、8W、12W、16W时,质量比为3：1的DCHA人工骨支架材料的钙离子浓度高于质量比为4：1的DCHA人工骨支架材料的钙离子浓度(P<0.01),而磷离子浓度无显著性差异(P>0.05)。质量比为3：1和4：1的DCHA人工骨支架材料的降解速度无显著性差异(P>0.05)。随着降解时间的延长,质量比为3：1和4：1的DCHA人工骨支架材料,抗压强度缓慢降低,2周时抗压强度分别为2.89±0.22 MPa和1.62±0.07 MPa；12周时4：1的DCHA人工骨支架材料失去骨支撑的强度,降为0.69±0.08 MPa,而3：1的DCHA人工骨支架材料仍有1.15±0.03 MPa的抗压强度；两种材料在各时间点抗压强度差异非常显著(P<0.01)。3.质量比为3：1和4：1的DCHA人工骨支架材料浸提液的细胞毒性均为0级；溶血率为：2.22%,小于5%,符合生物医学要求；所含热原符合规定；急性毒性程度分级均为0级；致敏反应记分均为0分。4. BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖,条件培养液诱导后表现出明显的成骨活性,细胞增殖良好,体外矿化结节Von Kossa染色阳性、茜素红染色阳性,证实其有成骨潜能。倒置相差显微镜、扫描电镜观察发现,细胞材料复合后,BMSCs在质量比为3：1和4：1的DCHA人工骨支架材料上均能够良好地粘附和增殖。ALP活性测定及MTS法测定OD值均证实,BMSCs细胞活性及成骨性能不受材料影响,与阴性对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。5.各组动物2周后均能自由活动、正常进食。手术切口无红肿、渗液,均Ⅰ期愈合,无死亡动物,末出现病理性骨折。实验组与及空白对照组的放射学及组织学检查评分显示,P<0.01,实验组优于空白对照组,两实验组无显著性差异(P>0.05),大体观实验组兔桡骨缺损完全愈合；空白对照组缺损基本无骨修复作用,由纤维组织充填。结论1.本研究将CHA粉碎成250μm-500μm的CHA微粒,然后将其与L-PLA以不同的质量比(2：1、3：1、4：1、5：1)混合均匀后为原料,采用Simpleware3.1软件,CAD构建数字化骨块模型,通过选择性激光烧结快速成形的工艺,可以制备出DCHA人工骨支架材料,其加工精度为+0.1cm,本方法充分利用和保留了珊瑚天然的微孔样结构,避免了制孔的繁琐工艺。2.通过一系列方法对DCHA人工骨支架材料进行表征发现,制备DCHA的原料中CHA微粒与L-PLA理想的质量比为3：1或4：1,采用这种质量比为原料制备的DCHA人工骨支架材料的孔径150μmm-350μm,孔与孔之间相互交通不规则,孔隙率为46.55%～52.65%,亲水率42.66%～46.29%,抗压强度1.82MPa～3.02 MPa。3.在体外模拟体液降解过程中,DCHA人工骨支架材料的pH值,在16周的降解周期内持续维持在7.35左右,16周的降解率为37%左右,介于CHA与L-PLA之间。体外模拟体液降解过程中,支架材料内部的孔径逐渐增大,孔隙逐渐增多,抗压强度逐渐下降,16周时下降为0.32MPa～0.55 MPa,基本还保持有天然松质骨的强度(0.4 MPa～11 MPa)。4.质量比为3：1或4：1的原料制备的DCHA人工骨支架材料无毒性、无热原性、不引起溶血反应、不会引起迟发性超敏反应,完全符合GB/T16886.1-2001 idt ISO 10993-1：1997中的标准要求,说明以3：1或4：1的原料制备的DCHA人工骨支架材料具有良好的生物学特性,符合作为骨组织工程材料的基本条件。5.质量比为3：1或4：1的原料制备的DCHA人工骨支架材料作为人工骨材料具有良好的细胞相容性。6.质量比为3：1或4：1的原料制备的DCHA人工骨支架材料修复兔胫骨干骺端腔隙性骨缺损,显示出良好的骨传导作用和生物相容性；DCHA人工骨支架材料在骨缺损部位可逐步降解并与骨修复相适应,成骨效果好,显示了DCHA人工骨支架材料作为理想人工骨支架材料的诱人前景,有望成为治疗临床骨缺损的一种新材料。