反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS)就是获得病毒的基因组序列后，借助于载体构建病毒的全长cDNA分子克隆，同时将RNA聚合酶的启动子元件导入到此分子克隆中，经体外转录合成病毒RNA，进一步去侵染宿主或敏感细胞系，增殖出大量的与原病毒相似的活病毒，与之相关的研究技术称为反向遗传学技术(Reverse genetics manipulation technique)，也被称为病毒拯救(Rescueof virus)。该技术为研究病毒蛋白功能、基因作用元件提供了方法，也使负链RNA病毒可作为载体表达外源基因。　　 新城疫是由新城疫病毒引起的禽类急性传染病。新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)新城疫样病毒属(Avulavirus)。新城疫病毒是不节段的负链RNA动物病毒，按其致病性的强弱新城疫病毒可分为三类：高致病性(强毒株)、中致病性(中毒株)和低致病性(弱毒株)。NDV LaSota株属于低致病性的弱毒株，多用作保护禽类的活疫苗。将NDV LaSota作为疫苗载体，有许多优势，如：可稳定表达外源基因，其与同源的RNA病毒不发生重组；安全稳定，成本低廉；弱毒株对人和动物无致病性；免疫接种途径简单；能够诱导机体产生良好的体液免疫、黏膜免疫及局部免疫等。将NDV LaSota作为疫苗载体有很大的应用前景，因而引起研究者更多的关注。　　 构建含有新城疫病毒全基因组的cDNA分子克隆和含有RNA复制酶及核蛋白的编码序列的辅助质粒，共同转染宿主细胞，从而建立新城疫病毒的反向遗传操作系统，从而实现新城疫病毒的拯救。在新城疫病毒基因组编码的六种蛋白中，L蛋白是病毒RNA聚合酶，与P蛋白形成具有完整聚合酶活性的复合物。P蛋白、NP蛋白和L蛋白与病毒基因组结合形成核糖核蛋白复合体(ribonucleoproteincomplex，RNP)是启动NDV的复制、转录和翻译所必需的。所以构建编码L蛋白的基因的表达质粒是建立NDV反向遗传操作系统的基础。　　 本试验通过在vero细胞中增殖病毒，用Trizol提取病毒RNA，应用长链RT-PCR法一次性扩增出约6.6kb的L基因，进一步将其与T-vecter相连亚克隆后，再与真核表达载体pcDNA3.1(+)相连，从而构建编码L蛋白的基因的表达质粒。经RT-PCR、免疫组化检测和限制性内切酶酶切鉴定以及基因测序认定L基因在BHK细胞中成功表达，L质粒构建成功。本研究为建立NDV的反向遗传操作系统奠定了基础，同时对长链RT-PCR法的条件优化和简化克隆的构建提供了参考。