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研究背景目前,原发性肺癌已成为我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。骨转移是晚期肺癌主要的血行转移部位之一。晚期肺癌患者中有30%~40%出现骨转移,而出现骨转移后患者的中位生存时间仅有6-10个月,五年生存率不足5%。Micro RNA(mi RNA)是一类内源性的、非编码的小RNA,其长度约为22nt。Mi RNA对细胞的增殖、分化、发育、凋亡等生物学行为有着重要的调控作用。Mi RNA是通过特异性结合目的m RNA的3’-untranslated region(3’UTR区)行使其调控功能,继而抑制目的基因的表达。Mi RNA可通过两条途径来完成对目的基因的抑制:一是m RNA水平剪切,二是翻译水平抑制。Mi RNA同样受转录水平和转录后水平的调控。Let7a-2是let7家族的一员,该家族具有高度保守的序列,行使相似的功能。Let7普遍表达于成人组织中,但是在肿瘤组织,特别是肺癌组织中低表达。然而目前尚未有研究能明确解释肿瘤细胞中mi RNA let7下调的原因。T Brachyury转录因子最初被发现在胚胎脊索中特异性表达,而正常人体组织表达阴性。近些年国内外许多学者发现Brachyury在多种肿瘤细胞,如肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、口腔鳞状细胞癌的组织中异常高表达。Brachyury作为一种转录因子,参与肿瘤细胞多种恶性生物学行为,如肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化、侵袭等。在多种癌症中,Brachyury的高表达与癌症患者的不良预后密切相关。研究目的探讨T Brachyury转录因子与mi RNA let7在肺癌中的调控关系和分子机制,并进一步研究两者对肺癌细胞生物学行为的影响,从新的角度阐明肺癌恶性生物学行为的发生机制,为Brachyury阳性表达肿瘤患者寻找新的抗肿瘤治疗方向奠定理论基础。研究方法1.通过建立Brachyury过表达细胞并采用基因微阵列(microarray)技术检测差异表达的mi RNA;2.通过网上公共数据库,采用生物信息学分析方法分析肺腺癌、肺鳞状细胞癌、浸润性乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、膀胱移行细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌中Brachyury与let7a-2的表达相关性;3.选择多个肿瘤细胞系进行Brachyury过表达或干扰,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测let7表达水平的变化;4.选择多个肿瘤细胞系进行let7a-2的过表达或干扰,采用Real-time PCR和蛋白质免疫印迹(Western Blot)技术检测Brachyury蛋白表达水平的变化;5.采用免疫组织化学染色技术检测肺癌骨转移标本中Brachyury的表达水平,采用micro RNA原位杂交组织化学技术检测肺癌骨转移标本中let7a2的表达水平,研究两者的表达相关性;6.采用荧光素酶报告系统(p GL4.1和p RL-CMV)和基因突变技术明确Brachyury对let7a-2的调控作用及具体调控位点;7.采用荧光素酶报告系统(p MIR和p RL-CMV)和基因突变技术明确let7a-2对Brachyury的调控作用及具体调控位点;8.在肺癌细胞系H460细胞中干扰Brachyury以及抑制let7a-2的表达,研究let7a-2下游基因表达变化;9.在肺癌细胞系H460细胞中干扰Brachyury以及抑制let7a-2的表达,研究上皮间质化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关基因表达变化;10.在肺癌细胞系H460细胞中干扰Brachyury以及抑制let7a-2的表达,研究对肺癌细胞增殖、迁徙和侵袭能力的影响。结果1.Brachyury过表达的肺癌细胞系H1299细胞中let7a-2的表达量出现下调;2.采用生物信息学分析研究发现,在肺腺癌和肺鳞状细胞癌中Brachyury与let7a-2表达量呈负相关;在浸润性乳腺癌中Brachyury与let7a-2表达量呈正相关;在头颈部鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、膀胱移行细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌中Brachyury与let7a-2表达量无相关性;3.Brachyury表达阳性的人肺癌细胞系H460、人黑色素瘤细胞系SK-MEL-28、人肝癌细胞系7402进行Brachyury Si RNA干扰,发现let7a-2表达量上调;对Brachyury表达阴性的人肺癌细胞系H1299、人前列腺癌细胞系PC-3、人肾上皮细胞293T进行Brachyury过表达,发现let7a-2表达量下调;4.对Brachyury表达阳性的人肺癌细胞系H460、人黑色素瘤细胞系SK-MEL-28、人肝癌细胞系7402进行let7a-2过表达,发现Brachyury蛋白表达量下调;对Brachyury表达阴性的人肺癌细胞系H1299、人前列腺癌细胞系PC-3、人肾上皮细胞293T进行let7a-2干扰,发现Brachyury蛋白表达量上调;5.在肺癌骨转移组织标本中,Brachyury与let7a-2的表达量呈负相关性;6.Brachyury可直接结合至let7a-2启动子区-1343~-1329bp区域,抑制let7a-2的表达;7.Let7a-2可与Brachyury的3’UTR区的特异性序列产生互补配对,从而抑制Brachyury的表达;8.在H460细胞中干扰Brachyury后,NRAS和Cyclin D2的表达水平出现下调,在此基础上再抑制let7a-2后,NRAS和Cyclin D2的表达水平下调;9.在H460细胞中干扰Brachyury后,E-cadherin的表达水平出现上调,在此基础上再抑制let7a-2后,E-cadherin的表达水平部分恢复;10.Brachyury—let7a-2负反馈环路可促进肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。结论1.在多种肿瘤细胞,特别是肺癌中,T Brachyury转录因子与micro RNA let7a-2存在负相关性;2.T Brachyury转录因子与micro RNA let7a-2存在相互的负性调控关系;3.Brachyury—let7a-2负反馈环路可正性调控NRAS和Cyclin D2、负性调控E-cadherin;4.Brachyury—let7a-2负反馈环路可促进肺癌细胞增殖、迁移和转移能力。