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双酚A(Bisphenol A,BPA)是生产聚碳酸酯塑料、环氧树脂、阻燃剂、食品饮料包装涂料等产品的中间体、终产物和惰性成分。BPA作为内分泌干扰物，能够模仿雌激素的功能，对生殖器官造成损害。与物理和化学方法相比，细菌降解是一种经济、环保的BPA降解方法。本研究旨在分离和鉴定能够降解和耐受高浓度BPA的菌株，研究影响降解过程的因素，并研究该菌株的降解机理。从土壤中分离得到2株具有高效降解BPA能力的革兰氏阴性菌YC-AE1和YC-AE2，并利用16S rRNA基因序列和BIOLOG鉴定系统分别鉴定为恶臭假单胞菌和反硝化无色杆菌。
采用中心复合设计的响应面法对菌株YC-AE1降解BPA的环境因素进行统计优化，显著性模型得到最佳初始pH、温度和接种量分别为7.2、30℃和2.5%。长时间的低NaCl浓度培养可以改善BPA的生物降解。方差分析显示决定系数高，R2和Adj-R2分别为0.9979和0.9935。底物分析发现，菌株YC-AE1可降解双酚B、双酚F、双酚S、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙基己酯、邻苯二甲酸二乙酯等多种相关污染物。此外，与报道的菌株(40小时内75%的BPA)相比，YC-AE1能够在更短时间内矿化BPA。
另外，利用单因素法优化YC-AE2对BPA的降解，发现最优共底物、pH和温度分别为蔗糖、8和30℃。NaCl能抑制YC-AE2对BPA的降解，而接种量的增加则有促进作用。YC-AE1和YC-AE2对不同浓度的BPA均有较强的降解能力(0.5-1000mg l?1)，分别能够在72小时内完全降解500mg/l和200mg/l的BPA。HPLC-MS检测发现，YC-AE1降解BPA中间产物有4,4-二羟基-α-甲基二苯乙烯、对羟基苯醛、对羟基苯乙酮、4-羟基苯基乙酸酯、2,4-二羟基苯乙酮、2,2-二(4-羟基苯基)-1-丙醇、1,2-二(4-羟基苯基)-2-丙醇和2,2-二(4-羟基苯基)丙酸酯，然而YC-AE2的降解中间产物只检测到3种，对羟基苯乙酮、1,2-二(4-羟基苯基)-2-丙醇和4,4-二羟基-α-甲基二苯乙烯。
利用RNA测序分析了YC-AE1菌株降解BPA时的差异表达基因(DEGs)。差异表达基因共有1229个，其中上调725个，下调504个。KEGG富集分析表明，不同环境下DEGs中微生物代谢途径显著富集。qRT-PCR进一步证实了10个涉及BPA降解途径的基因。为阐明其分子机制，我们构建了细胞色素CYP450(bisdB)缺陷株△bisdB。与野生型相比，△bisd对BPA的降解能力明显降低。实验发现，CYP450抑制剂能够显著降低YC-AE1降解BPA的效率。此外，将基因bisdB(CYP450)和bisdAB(CYP450和铁氧化还原蛋白)克隆到pET-32a，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。含有pET-32a-bisdAB的大肠杆菌能够在24小时内降解100mg/L的BPA。综上，我们研究了细胞色素P450单加氧酶在BPA分解代谢中的分子基础和潜在作用。结果表明，恶臭假单胞菌YC-AE1和反硝化无色杆菌YC-AE2具有巨大的未被开发的生物技术潜力，可进一步用于生物技术的应用，特别是在双酚类物质的生物修复方面。
采用中心复合设计的响应面法对菌株YC-AE1降解BPA的环境因素进行统计优化，显著性模型得到最佳初始pH、温度和接种量分别为7.2、30℃和2.5%。长时间的低NaCl浓度培养可以改善BPA的生物降解。方差分析显示决定系数高，R2和Adj-R2分别为0.9979和0.9935。底物分析发现，菌株YC-AE1可降解双酚B、双酚F、双酚S、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙基己酯、邻苯二甲酸二乙酯等多种相关污染物。此外，与报道的菌株(40小时内75%的BPA)相比，YC-AE1能够在更短时间内矿化BPA。
另外，利用单因素法优化YC-AE2对BPA的降解，发现最优共底物、pH和温度分别为蔗糖、8和30℃。NaCl能抑制YC-AE2对BPA的降解，而接种量的增加则有促进作用。YC-AE1和YC-AE2对不同浓度的BPA均有较强的降解能力(0.5-1000mg l?1)，分别能够在72小时内完全降解500mg/l和200mg/l的BPA。HPLC-MS检测发现，YC-AE1降解BPA中间产物有4,4-二羟基-α-甲基二苯乙烯、对羟基苯醛、对羟基苯乙酮、4-羟基苯基乙酸酯、2,4-二羟基苯乙酮、2,2-二(4-羟基苯基)-1-丙醇、1,2-二(4-羟基苯基)-2-丙醇和2,2-二(4-羟基苯基)丙酸酯，然而YC-AE2的降解中间产物只检测到3种，对羟基苯乙酮、1,2-二(4-羟基苯基)-2-丙醇和4,4-二羟基-α-甲基二苯乙烯。
利用RNA测序分析了YC-AE1菌株降解BPA时的差异表达基因(DEGs)。差异表达基因共有1229个，其中上调725个，下调504个。KEGG富集分析表明，不同环境下DEGs中微生物代谢途径显著富集。qRT-PCR进一步证实了10个涉及BPA降解途径的基因。为阐明其分子机制，我们构建了细胞色素CYP450(bisdB)缺陷株△bisdB。与野生型相比，△bisd对BPA的降解能力明显降低。实验发现，CYP450抑制剂能够显著降低YC-AE1降解BPA的效率。此外，将基因bisdB(CYP450)和bisdAB(CYP450和铁氧化还原蛋白)克隆到pET-32a，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。含有pET-32a-bisdAB的大肠杆菌能够在24小时内降解100mg/L的BPA。综上，我们研究了细胞色素P450单加氧酶在BPA分解代谢中的分子基础和潜在作用。结果表明，恶臭假单胞菌YC-AE1和反硝化无色杆菌YC-AE2具有巨大的未被开发的生物技术潜力，可进一步用于生物技术的应用，特别是在双酚类物质的生物修复方面。