乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染仍然是一种严重影响人类健康的传染性疾病,全球约20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿人为慢性HBV感染者,每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌。我国现有的慢性HBV感染者约9300万,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者约2000万。自从1992我国卫生部将乙型肝炎疫苗纳入计划免疫管理后我国HBV感染率逐渐下降,但是我国慢性HBV感染者中约有30-50%是通过母婴传播形成的,对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性母亲的新生儿,应在出生后24小时内尽早(最好在出生后12小时)注射乙型肝炎免疫球蛋白(Hepatitis B Immunoglubulin, HBIG)。肝移植是治疗终末期肝病的有效手段,而目前我国接受肝移植的患者中90%以上患有HBV感染相关性疾病,由于肝移植不能清除肝外脏器血液及单核细胞等处的HBV,术后乙型肝炎容易复发,并且由于器官受体在术后处于免疫抑制状态,CHB复发后肝炎进展速度较术前明显加快,可导致急性肝功能衰竭、纤维性胆汁淤积性肝炎、肝硬化,2年病死率高达50%,拉米夫定联合HBIG是目前预防HBsAg (+)肝移植术后病人HBV再感染的有效方法。另外医务工作者等意外接触HBV感染者的血液和体液后,如未接种过乙型肝炎疫苗,或虽接种过乙型肝炎疫苗,但乙型肝炎病毒表面抗原的抗体(抗-HBs)<10mIU/mL或抗-HBs水平不详者,也应立即注射HBIG。HBIG是利用抗-HBs阳性的个体血浆制备而成的,含高浓度特异性抗-HBs的免疫球蛋白。该药为血源制品,不便大量制备,也有传播其他血源性疾病的风险,且该药个体差异较大,是多克隆制剂,均一性欠佳。本研究采用EBV永生化以及用分子生物学方法构建抗体基因库后从全长抗体基因库中筛选的技术,探索制备性质均一的单克隆抗-HBs。一、应用EBV永生化技术制备抗-HBs方法(1)制备EBV:培养B95-8细胞,制备EBV悬液。(2)准备CpG及环孢素：由上海英俊生物技术有限公司合成B细胞多克隆激活剂CpGDNA(序列：TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT);购买环胞菌素A (cyclosporin A, CyA)。(3)获取强化免疫健康志愿者的PBMC：给予3位已进行全程计划免疫的20～25岁健康志愿者加强接种重组乙型肝炎疫苗1次,1周后抽取静脉血30ml,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)层,计数细胞数目,用含20%FBS的RPMI-1640完全培养基混悬细胞,调整密度为1×106个/ml。(4) EBV转化PBMC建立永生化的B淋巴细胞系：将上述PBMC种入24孔板,每孔加1 ml,含1×106个细胞,每孔再加入1 ml制备的EBV悬液,使EBV感染其中的B细胞。37℃、5%CO2培养18～24小时后,用含有CpG2.5μg/ml和环孢素A2μg/ml的完全RPMI-1640培养基半换液；1周后首次换液,调整CyA浓度为1μg/ml,此后每周半换液,雅培方法检测细胞培养上清中的抗-HBs抗体滴度。(5)制备饲养细胞：一个月后取部分永生化的B淋巴细胞以10 Gy剂量的γ射线照射1分钟后作为饲养细胞。(6)有限稀释法培养：在96孔板中每孔加入饲养细胞5×104个,然后加入培养上清抗-HBs阳性的永生化B淋巴细胞,做1个/孔,2个/孔,10个/孔三种细胞梯度各20个孔,每孔完全培养基200u1,另做5孔只加入饲养细胞做对照。培养7-14天后,选择抗-HBs阳性孔中的单细胞重新种入96孔板中,重复此过程培养2次,直至100%为抗-HBs分泌细胞。(7)免疫细胞化学染色(ICC)检测永生化的B淋巴细胞：超敏生物素-链霉亲和素SP法,DAB显色。缓冲液代替一抗作阴性对照；HBV感染的肝组织作阳性对照。CD20和CD138按说明书操作；检测乙肝表面抗体时,封闭后除去血清,每张切片加1：50稀释的重组HBsAg 50μl,室温下孵育60分钟,其余步骤按试剂盒说明书进行。结果三例健康志愿者PBMC与EBV共孵育24小时后,即可见细胞形态呈母细胞样改变,倒置显微镜下观察可见细胞体积增大,细胞质丰富,呈球形。3～5天后可见增殖的细胞集落,悬浮或略贴壁生长,集落间散在的细胞逐渐减少,3-4周集落明显增大。细胞在液氮中保存4周～3个月后多次复苏活性良好,台盼蓝法计数,活细胞比率>95%,复苏的细胞可继续培养和传代,建立的永生化B淋巴细胞系可连续传代培养3个月以上。三例健康志愿者PBMC经EBV转化后,用雅培方法动态检测细胞培养上清中的抗-HBs滴度,细胞培养上清抗-HBs的滴度维持在较高水平可持续2周左右,3周后逐渐降低以至消失。永生化B细胞培养2个月后,细胞甩片做免疫细胞化学染色,CD20阳性棕黄色颗粒主要见于细胞膜,着色强度+～++；CD138阳性可见于细胞膜/细胞浆,呈团状、块状及线团状或弥散分布,着色强度++；抗-HBs阳性可见于细胞膜,着色强度+,细胞核未见阳性着色；阴性对照细胞则无明显的棕黄色着色颗粒。结论(1)采用改进的EBV永生化技术,联合应用B细胞多克隆刺激剂CpG可以高效转化志愿者乙肝疫苗强化接种后的PBMC,成功实现B细胞的永生化,经有限稀释克隆化培养可以成功获得单克隆B淋巴细胞。(2)永生化的B淋巴细胞培养上清抗-HBs滴度维持较高水平2周左右,之后逐渐降低。由于EBV永生化的B淋巴细胞随着培养时间的延长抗体分泌功能减退,进一步,我们尝试应用基因工程技术构建抗体基因库,从中表达并筛选全长人源抗-HBs单克隆抗体。二、应用哺乳动物细胞表面展示技术从抗体基因库中筛选抗-HBs方法：获取乙肝疫苗全程免疫成功且抗-HBs高滴度的健康志愿者的PBMC,提取总RNA,设计并合成引物,扩增得到全套IgG1链可变区基因(VH)和K型轻链全长基因(LCK),应用SfiⅠ酶切真核表达载体pDGB-HC-TM(本课题组已构建好)和LCK基因,应用BsmBⅠ酶切真核表达载体pDGB-HC-TM和VH基因,T4DNA连接酶连接过夜,化学转化感受态大肠杆菌TOPO10,接种于含有氨苄青霉素的平皿。轻、重链各随机挑选10个克隆接种扩增后送Invitrogen公司测序,根据长出的克隆数计算轻链或重链抗体基因库库容量,收集混合所有菌落即为轻链或重链抗体基因库。应用BstXⅠ酶切轻链基因库,BsmBⅠ酶切重链基因库,应用BstXⅠ和BsmBⅠ先后酶切pDGB4-FCS,T4DNA连接酶做四片段连接,化学转化感受态大肠杆菌TOPO10,接种于含有氨苄青霉素的平皿,挑选10个单克隆接种扩增,计算库容量,收集混合所有菌落即得到同时含有IgG1-Kappa型轻链、重链的完整抗体基因库。将随机挑选的10个轻链单克隆质粒DNA与pDGB-HC-TM(此质粒经鉴定已证实可以表达全长的重链)匹配瞬时转染FCHO细胞,将随机挑选的10个重链单克隆质粒DNA与pDGBCZR1(此质粒经鉴定已证实可以表达全长的轻链)匹配瞬时转染FCHO细胞；轻链抗体基因库与重链抗体基因库匹配瞬时转染FCHO细胞；将完整抗体基因库稳定转染FCHO细胞。流式细胞仪分析IgG1-Kappa型抗体及抗-HBs在FCHO细胞表面的表达,由FCS Express V3软件对流式细胞仪产生的数据进行分析。流式细胞仪分选表达抗-HBs的细胞群及单细胞,分选富集到的细胞群及单细胞培养后进一步检测抗-HBs表达状况,收集单细胞的培养液ELISA检测抗-HBs的表达。结果：利用本课题组已经构建的载体,以全程免疫健康志愿者的外周血淋巴细胞为材料,应用哺乳动物细胞表面展示技术建立了库容量分别为1.7×105的抗体重链基因库(IgG1)和1.2×105的抗体轻链基因库(Kappa链)。从中随机挑选单克隆抗体基因测序分析,发现10个重链克隆均含有10个含有正确的VH编码序列,编码10个特异的氨基酸序列；10个轻链克隆有9个含有正确的LCκ编码序列,编码9个特异的氨基酸序列。将此重链库和轻链库共转染哺乳动物细胞后,理论上抗体库的多样性可以达到1.836×10170。流式细胞仪分析显示7/10的轻链克隆、10/10的重链克隆可成功表达抗体,重链抗体基因库与轻链抗体基因库配对转染FCHO后,66.53%细胞表面可以检测到抗体表达,最高可表达库容量达1.428×1010。将全套轻、重链基因一起插入同步表达载体中,构建了库容量达7.27x104的IgG1-Kappa型乙肝特异性完整抗体基因库,稳定转染FCHO细胞后流式细胞仪检测到1.73%的细胞表达抗-HBs。经一轮流式细胞仪分选富集,抗-HBs阳性率可提高5倍以上,流式分选最终共筛选到26个单克隆细胞,培养后流式检测其中11个单克隆细胞抗-HBs阳性,经ELISA检测得到3个抗-HBs阳性单克隆细胞。结论应用哺乳动物细胞表面展示技术可构建大容量乙肝特异性全长人源抗体基因库,联合流式细胞技术可有效分选富集表达抗-HBs特异性抗体的细胞群,从中成功筛选得到抗-HBs单克隆细胞。