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研究背景：多囊卵巢综合征（PCOS）是常见的内分泌及代谢紊乱性疾病，主要表现为高雄激素血症、卵巢多囊样改变及稀发排卵或无排卵，常伴有胰岛素抵抗或胰岛细胞功能障碍，致使其合并2型糖尿病、代谢综合征和心血管疾病的远期风险增加。高雄激素血症是PCOS的主要临床特征之一，其雄激素来源于卵巢和肾上腺，并以卵巢来源为主，但PCOS患者高雄激素血症的确切病因与病理生理机制仍不清楚。为研究PCOS发生发展的分子机制，本实验室前期通过基因芯片技术比较正常育龄妇女和PCOS患者卵巢内的全基因组表达谱，发现PCOS患者卵巢中SET基因高表达，其表达水平是正常卵巢的2倍多。SET蛋白在全身多个组织器官中均有表达，包括中枢神经系统、肾上腺和性腺的甾体激素合成细胞。既往研究表明，在人神经前体细胞及小鼠睾丸间质细胞中SET蛋白能够激活基础状态及激素刺激状态下的CYP17A1基因转录；在多种细胞中SET能抑制PP2A酶活性，而在NCI-H295A细胞系中PP2A能够使P450c17丝氨酸、苏氨酸去磷酸化从而使P450c17裂解酶活性增加。我们推测，SET蛋白在人卵巢中参与调节雄激素生成与释放；而PCOS患者卵巢组织SET高表达则可能参与了高雄激素血症发生发展的病理生理机制。再则，SET蛋白在卵巢中参与雄激素生成调节和PCOS高雄激素的机制更需要细致研究。为了验证上述三项科研假说，本研究首先验证SET蛋白在卵巢中的细胞与亚细胞定位以及SET蛋白在PCOS卵巢中的高表达；通过SET重组腺病毒载体实现SET在小鼠卵泡及膜-间质细胞中的超表达和干涉，观察SET对膜细胞雄激素合成的影响；然后通过酶动力学研究、RNAi、化学激动剂抑制剂、免疫荧光共定位及免疫共沉淀等技术，阐明SET在调控雄激素生成中的作用机制。这些前沿性的研究，将阐述SET蛋白在人卵巢中调节雄激素生成的作用及其机制，也将有助于探讨SET在PCOS高雄激素血症中的病理生理作用，为PCOS研究提供新的思路。材料和方法第一部分：SET在多囊卵巢综合征和正常育龄妇女卵巢中的定位及差异表达1.免疫组织化学方法观察SET蛋白在人卵巢组织中的细胞及亚细胞定位。2.通过Western blot比较SET蛋白在PCOS和正常育龄妇女卵巢组织中的表达。第二部分：SET对小鼠窦前卵泡雄激素合成的影响1.通过免疫组化方法观察SET蛋白在小鼠卵巢组织中的细胞及亚细胞定位。2.重组腺病毒AdCMV-SET和AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡48小时后，Western blot验证SET在卵泡膜细胞中的超表达及干涉效率，酶联免疫法测定培养液中睾酮的浓度。3.重组腺病毒AdCMV-SET和AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡48小时后，Real-time RT-PCR检测雄激素生成相关的酶StAR、CYP11A1、CYP17A1、HSD3B2mRNA水平。第三部分：SET通过PP2A调节小鼠窦前卵泡雄激素合成1.重组腺病毒AdCMV-SET和AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡24小时后，超高效液相色谱-串联质谱法检测P450c17裂解酶活性变化，Western blot检测P450c17蛋白表达变化。2. Real-time RT-PCR检测AdCMV-SET和AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡24小时后POR及CYB5的mRNA水平改变。3.通过冰冻切片免疫荧光观察PP2A在小鼠卵巢组织中的表达定位。4.通过免疫荧光共定位观察SET和PP2A在小鼠膜-间质细胞中相互关系。5.通过免疫荧光共定位和免疫共沉淀方法，观察PP2A和P450c17在小鼠膜-间质细胞中的相互关系。6.重组腺病毒AdCMV-SET和AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡24小时后，通过PP2A免疫沉淀磷酸酶检测试剂盒检测超表达及干涉SET对PP2A酶活性的影响，Western blot检测超表达及干涉SET对PP2A蛋白表达的影响。7. PP2A化学抑制剂OA及激动剂1,9-dideoxyforskolin，FTY720分别处理小鼠卵泡48小时，酶联免疫法测定培养液中睾酮的浓度；AdH1-SiRNA/PP2A腺病毒载体感染小鼠卵泡48小时，酶联免疫法测定培养液中睾酮的浓度，超高效液相色谱-串联质谱法检测P450c17裂解酶活性，western blot检测P450c17蛋白水平。8. AdH1-SiRNA/SET或AdH1-SiRNA/NS重组腺病毒感染小鼠卵泡24小时后加入PP2A抑制剂OA，24小时后酶联免疫法测定卵泡培养液中睾酮含量。结果第一部分：SET在多囊卵巢综合征和正常育龄妇女卵巢中的定位及差异表达1.在人卵巢组织中，SET蛋白主要表达于卵泡膜细胞及卵母细胞；在膜细胞中主要定位于细胞质及细胞核中。2. PCOS患者卵巢组织中SET蛋白表达较正常育龄妇女卵巢明显升高，约为正常育龄妇女的3倍（p<0.05）。第二部分：SET对小鼠窦前卵泡膜细胞雄激素合成的影响1. SET蛋白在小鼠卵巢中主要表达于膜细胞、卵母细胞，与人卵巢组织中的表达一致；在小鼠初级卵泡、窦前卵泡及窦卵泡的膜细胞中均有表达；在膜细胞中，SET蛋白定位于细胞核及细胞质。2.重组腺病毒AdCMV-SET感染小鼠卵泡膜细胞48小时后，SET蛋白表达较AdCMV-GFP感染组增加1.79倍(p<0.05)，睾酮的浓度显著升高（177.42±54.94pg/ml vs79.43±25.23pg/ml）(p<0.05)；相反，重组腺病毒AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡膜细胞48小时后，AdH1-SiRNA/SET感染组SET蛋白表达较AdH1-SiRNA/NS感染组显著降低（p<0.05)，干涉效率达48%，睾酮浓度显著降低（73.59±21.34pg/ml vs33.11±6.64pg/ml）(p<0.05)。3.重组腺病毒AdCMV-SET感染小鼠卵泡膜细胞24小时后，与AdCMV-GFP感染组相比，AdCMV-SET感染组卵泡SET mRNA水平显著增加（p<0.05），为对照组的1.66倍，雄激素生成酶CYP17A1、HSD3B2mRNA表达显著增加（p<0.05），分别为对照组的2.46倍、3.36倍，而CYP11A1，StAR mRNA无明显改变（p>0.05）。相反，重组腺病毒AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡膜细胞24小时后，与AdH1-SiRNA/NS感染组相比，CYP17A1、HSD3B2mRNA表达显著下降(p<0.05)，分别下降33%和70%，而CYP11A1，StAR mRNA无明显改变（p>0.05）。第三部分：SET通过PP2A调节小鼠窦前卵泡雄激素合成1.重组腺病毒AdCMV-SET感染小鼠卵泡膜细胞24小时后，P450c17裂解酶活性升高(p<0.05)，而P450c17蛋白表达无明显影响(p>0.05)；相反，重组腺病毒AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡膜细胞24小时后，P450c17裂解酶活性降低(p<0.05)，P450c17蛋白表达无明显影响(p>0.05)。2.重组腺病毒AdCMV-SET或AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵泡膜细胞24小时后，POR及CYB5mRNA水平均无明显影响(p>0.05)。3. PP2A蛋白在小鼠卵巢广泛表达，主要表达于膜细胞、颗粒细胞、间质细胞等。4.在小鼠膜-间质细胞中SET定位于细胞核和细胞质中，且在细胞核中信号较强。而PP2A主要定位于细胞质中，与SET在细胞质中部分共定位。5.在小鼠膜-间质细胞中PP2A和P450c17在细胞质中共定位且相互结合。6.重组腺病毒AdCMV-SET感染小鼠卵泡24小时后，与对照组相比，PP2A蛋白表达量无明显改变(p>0.05)，而PP2A酶活性显著下降(p<0.05)，约为对照组的43%；相反，重组腺病毒AdH1-SiRNA/SET感染小鼠卵巢膜细胞24小时后，与对照组相比，PP2A蛋白表达量无明显改变(p>0.05)，而PP2A酶活性显著升高(p<0.05)，为对照组的1.45倍。7. PP2A化学抑制剂OA处理卵泡48小时后，睾酮生成较DMSO组明显升高（252.13±92.83pg/ml vs93.46±2.91pg/ml）(p<0.05)；PP2A化学激动剂1,9-dideoxy-forskolin和FTY720处理卵泡48小时后，睾酮浓度较DMSO组下降（74.84±13.85pg/ml vs65.63±22.10pg/ml；104.77±15.80pg/ml vs65.63±22.10pg/ml）(p<0.05)。重组腺病毒AdH1-SiRNA/PP2A感染小鼠卵泡膜细胞48小时后，PP2A蛋白表达较AdH1-SiRNA/NS感染组显著降低（p<0.05)，睾酮浓度显著升高（214.19±40.86pg/ml vs91.07±23.42pg/ml）(p<0.05)。AdH1-SiRNA/PP2A感染小鼠卵泡膜细胞24小时后，P450c17裂解酶活性升高(p<0.05)，而P450c17蛋白表达无明显变化(p>0.05)。8. AdH1-SiRNA/SET或AdH1-SiRNA/NS重组腺病毒感染卵泡24小时后加入PP2A抑制剂OA，AdH1-SiRNA/SET+DMSO组睾酮浓度较AdH1-SiRNA/NS+DMSO组降低（41.55±10.30pg/ml vs111.19±14.17pg/ml）(p<0.05)，AdH1-SiRNA/SET+DMSO组睾酮浓度较AdH1-SiRNA/SET+OA组降低（41.55±10.30pg/ml vs115.47±23.23pg/ml）(p<0.05)，而AdH1-SiRNA/NS+DMSO组睾酮浓度较AdH1-SiRNA/SET+OA组无明显差异（111.19±14.17pg/ml vs115.47±23.23pg/ml）(p>0.05)。结论1. SET蛋白在PCOS患者卵巢中较正常育龄妇女卵巢高表达，且主要表达于膜细胞和卵母细胞；SET在小鼠初级卵泡、窦前卵泡及窦卵泡的膜细胞中均高表达，且定位于细胞核及细胞质。提示SET参与卵泡膜细胞某种(些)生物学过程的调控。2. SET蛋白在小鼠窦前卵泡中正向调节睾酮的合成，促进雄激素生成酶CYP17A1、HSD3B2mRNA表达，并促进P450c17裂解酶活性，而对POR及CYB5mRNA水平无明显影响。因此，SET参与调节卵泡膜细胞的雄激素生成。3. PP2A表达于卵泡膜细胞、间质细胞、颗粒细胞等，与SET在细胞质部分共定位；在小鼠膜-间质细胞中，PP2A和P450c17在细胞质中共定位且相互结合。PP2A抑制小鼠卵泡睾酮合成及P450c17酶活性，SET蛋白通过抑制PP2A酶活性，促进P450c17裂解酶活性进而导致卵泡雄激素合成增加。所以，SET调节雄激素生成的分子机制是：SET通过抑制PP2A酶活性促进P450c17裂解酶活性增加，从而使雄激素生成增加。4.本研究首次提示了卵巢中SET蛋白通过PP2A调控P450c17裂解酶活性，从而参与卵巢膜细胞雄激素生成的调节；而PCOS卵巢高表达SET蛋白，是PCOS高雄激素血症的病理机制之一。