【背景】Wnt信号通路是一条生物体内高度保守的,参与调控胚胎的生长发育以及细胞增殖、迁移和凋亡的信号转导通路。该通路启动蛋白由Wnt基因编码,在正常胚胎的发育甚至肿瘤的发生发展中都起着至关重要的作用。Wnt蛋白大致可分为两类,一类是Wnt1类,主要包括Wnt1、Wnt3a以及Wnt8a和Wnt8b,可以激活经典Wnt信号通路,即Wnt/β-catenin信号通路;另一类是Wnt5a类,包括Wnt5a、Wnt4以及Wnt11,可激活非经典Wnt信号通路,包括Wnt/Ca2+通路及Wnt/JNK信号通路。Wnt介导的Wnt/JNK信号通路调控着细胞极性及细胞间协同极化,诱导非对称的细胞骨架形成、细胞骨架重排和细胞迁移。这条通路中需要Wnt5a与frizzelds蛋白受体结合,磷酸化c-Jun蛋白激酶(JNK)上的苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)两个磷酸化位点,活化的JNK可易位到细胞核内导致c-Jun蛋白上Ser63和Ser73两个N氨基末端上氨基酸残基磷酸化,进而引起一些核内转录因子如Elk-1、ATF2、DPC4、NFAT4及ets-2等的活化,或者直接活化调控胞浆中的细胞骨架蛋白如桩蛋白(Paxillin)等。wnt5a/jnk信号通路和肿瘤关系密切,很多研究证明wnt5a/jnk在胃癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的增殖、侵袭和转移中发挥着关键性的作用。在恶性肿瘤中,wnt5a可以活化jnk,而活化的jnk信号通路与增强肿瘤细胞耐药、调控细胞凋亡、促进细胞生存或生长有关。根据已有的文献资料及我们的前期研究发现恶性黑素瘤中wnt5a是处于激活状态的,它在恶性黑素瘤的发生、发展过程中可能有着重要作用,但wnt5a是否通过jnk通路发挥作用尚不清楚。因此,本课题采用慢病毒转染使两种黑素瘤细胞系的wnt5a发生上调或下调,并用real-timepcr方法检测转染后的稳转细胞系中wnt5a、dvl、jnk、paxillin、cd44、icam、mmp1、mmp2、cyclina、cyclind的mrna表达量,用westernblot检测稳转细胞系中wnt5a、jnk、p-jnk、paxillin、p-paxillin蛋白的表达,用cck-8实验、划痕实验、transwell小室实验分别检测稳转细胞系的增殖、转移以及侵袭的能力,进一步揭示了wnt5a/jnk这一信号通路在黑素瘤发生、发展过程中的作用及意义。【目的】探讨调控wnt5a/jnk通路对黑素瘤细胞增殖、侵袭及转移能力的影响。【方法】1)体外培养慢病毒转染的稳转黑素瘤细胞系。2)real-timepcr方法检测稳转细胞系中wnt5a、dvl、jnk、paxillin、cd44、icam、mmp1、mmp2、cyclina、cyclind的mrna的表达;westernblot检测稳转细胞系中wnt5a、jnk、p-jnk、paxillin、p-paxillin蛋白的表达。3)cck-8实验检测稳转细胞系的增殖能力;划痕实验检测稳转细胞系的转移能力;transwell小室实验检测稳转细胞系的侵袭能力。【结果】1)wnt5a介导的jnk通路相关分子在慢病毒转染的稳转细胞系中的表达发生改变。我们前期检测了6株黑素瘤细胞,挑选出高表达wnt5a的wm793b细胞和低表达wnt5a的a2058细胞,并利用了慢病毒表达载体,构建了4株稳转细胞系:wm793b-plko.1-shwnt5a慢病毒稳转细胞系(利用shwnt5a慢病毒颗粒转染,表现为低表达wnt5a);wm793b-plko.1-scrambal对照慢病毒稳转细胞系(利用scrambal慢病毒空质粒对照颗粒转染,wnt5a表达未发生变化,表现为高表达wnt5a);a2058-plenti-wnt5a慢病毒稳转细胞系(利用plenti6.3-wnt5a慢病毒颗粒转染,表现为高表达wnt5a);a2058-plenti-cherry对照慢病毒稳转细胞系(利用plenti6.3-cherry慢病毒空质粒对照颗粒转染,wnt5a表达未发生变化,表现为低表达wnt5a)。而后我们利用real-timepcr方法从mrna水平检测了这四株稳转细胞系中wnt5a以及jnk通路相关信号分子的表达,发现wnt5a的表达与jnk通路下游的dvl、jnk、paxillin、cd44、icam、mmp1、mmp2、cyclina、cyclind的基因的表达呈正相关性。利用westernblot从蛋白水平检测wnt5a、jnk、paxillin、p-jnk、p-paxillin蛋白的表达,发现jnk和paxillin蛋白的变化不明显,但wnt5a的表达与p-jnk和p-paxillin蛋白的表达呈正相关性,而wnt5a可以通过磷酸化jnk和paxillin来调节肿瘤细胞的侵袭和转移。因此我们认为wnt5a/jnk通路在黑素瘤wm793b和a2058中是存在的。2)wnt5a/jnk通路调节黑素瘤细胞的增殖、侵袭和转移。为了检测wnt5a/jnk信号通路对黑素瘤增殖、侵袭和转移的影响,我们利用cck-8方法检测稳转细胞系的增殖能力,发现wnt5a上调能够增强黑素瘤细胞的增殖能力,反之,下调则会降低黑素瘤细胞的增殖能力。采用划痕实验检测了稳转细胞系的迁移能力,发现wnt5a上调能够增强黑素瘤细胞的迁移能力,下调则会降低黑素瘤细胞的迁移能力。采用transwell小室实验进一步对稳转细胞系的体外侵袭能力进行了检测,发现上调wnt5a能够增强黑素瘤细胞的侵袭能力,下调则会降低黑素瘤细胞的侵袭能力。【结论】1.wnt5a高表达可使jnk信号通路相关信号分子表达增强,反之,wnt5a低表达可使jnk信号通路相关信号分子表达下降。提示黑素瘤wm793b和a2058中存在wnt5a/jnk信号通路。2.调控wnt5a/jnk信号通路可引起jnk信号分子的改变,黑素瘤细胞增殖、侵袭和转移能力随之发生变化。提示wnt5a可影响jnk信号通路,wnt5a/jnk信号通路可能参与了黑素瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程。本课题对Wnt5a/JNK信号通路与黑素瘤生长、侵袭和转移的关系进行了初步探讨,为黑素瘤侵袭、转移机制的探讨及靶向治疗提供了初步理论依据。