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菌核病是由核盘菌引起的一种严重威胁油菜产量和品质性状的真菌性病害。核盘菌通过向寄主植物分泌细胞壁降解酶CWDEs、多聚半乳糖醛酸酶PGs和病原菌相关的分子PAMPs等与寄主植物建立侵染关系。为了抵御病原菌的侵染,植物进化出一类多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIPs来抑制PGs的活性。本研究在甘蓝型油菜7-5(低抗)、P61-5(高感)和T45(高感)材料中超表达水稻的Os PGIP2基因,通过分子鉴定和抗性鉴定筛选出了16个菌核病抗性显著提高的T1代转基因家系,之后继续对转基因家系的T2、T3和T4代进行分子鉴定、菌核病抗性鉴定、种子品质性状和千粒重的考察,最终获得了菌核病抗性显著改良且遗传稳定的转基因油菜种质资源。此外,利用RNA-seq技术分析了转基因和非转基因家系核盘菌侵染后的差异表达基因,提出转基因甘蓝型油菜中由Os PGIP2介导的抗病调控网络。主要研究结果如下:1.转基因家系中Os PGIP2的拷贝数鉴定和表达量分析对16个转基因家系进行Southern blot检测,确定7-5B、7-5C、7-5D、7-5G、7-5H、7-5J、T45B#1、T45B#2和T45C为单拷贝插入植株,7-5A、P61-5A、P61-5B#1和P61-5B#2为双拷贝插入植株,7-5M含有5个拷贝。q PCR检测发现,在不同转化事件的转基因家系中,Os PGIP2基因的表达水平存在较大差异;在同一转化事件中,Os PGIP2基因的表达量无显著性差异;在含有5个拷贝的7-5M家系中,Os PGIP2基因的表达量最低。同时,T2和T3代抗病性鉴定显示,除了7-5M家系,其它转基因家系菌核病抗性与非转基因对照相比都提到了显著提高。这些结果表明Os PGIP2基因已成功整合到甘蓝型油菜基因组中,Os PGIP2基因的低拷贝插入事件能够增加甘蓝型油菜的抗病性,而多拷贝插入事件易导致目的基因沉默。2.Os PGIP2转基因家系的抗病性鉴定与种子千粒重和品质性状分析T4代转基因家系离体叶片接菌72 hpi的菌斑面积都显著小于非转基因家系;喷菌丝存活率实验显示转基因家系具有良好的苗期抗性;成株期模拟极端疾病压力实验证明转基因家系的发病率低于非转基因家系;在离体茎秆接菌和田间茎秆接菌实验中,转基因家系菌斑长度都显著小于非转基因家系。成株期接种核盘菌后,转基因家系种子中芥酸和蛋白质的含量与非转基因家系相比无显著差异,而转基因家系种子千粒重和含油量都显著高于非转基因家系。以上结论证明,转化Os PGIP2基因能够改良甘蓝型油菜7-5、T45和P61-5的苗期和成株期菌核病抗性,同时能够保证种子的千粒重和品质性状更少的受到菌核病影响。3.解析Os PGIP2介导的防卫反应途径RNA-seq结果显示,Os PGIP2介导的抗病反应主要依赖于调节与RLKs(receptor-like kinases)、细胞内钙和离子转运、过氧化物产生和H2O2清除相关基因、JA/ET及生长素、转录因子、疾病防卫反应相关基因、细胞壁重建、CYP/GSH/Histone、碳源代谢和转运等相关的植物先天免疫反应路径。DAB staining和q PCR结果显示,Os PGIP2转基因家系中H2O2的积累和氧化还原反应相关基因的表达都显著高于非转基因家系。Os PGIP2转基因家系茎秆细胞壁单糖含量的测定结果显示,油菜茎秆中阿拉伯糖、木糖、纤维素、甘露糖和木质素的含量随花期的发展逐渐增加,在终花期Os PGIP2转基因家系的纤维素、半纤维素和甘露糖的含量都显著高于非转基因家系,说明转入Os PGIP2可能影响细胞壁糖类组成相关途径来提高油菜的菌核病抗性。4.Ss PGs和Os PGIP2互作分析油菜叶片提取物培养核盘菌发现,核盘菌在加入Os PGIP2转基因叶片提取物的培养基上生长显著延缓,菌丝排布紧密,而对照中核盘菌生长快,菌丝排列松散。q PCR检测接菌茎秆中的核盘菌致病基因Ss PGs的表达量显示,Os PGIP2转基因家系中Ss PGs的表达显著低于对照。比较Os PGIP2与核盘菌PGs之间互作的亲和性发现,Os PGIP2与Ss PG3和Ss PG6的亲和性高于Os PGIP2与Ss PG1和Ss PG5的亲和性。利用Splite luciferase(LUC)互作实验进一步证实Os PGIP2能够与Ss PG3和Ss PG6互作,而不与Ss PG1和Ss PG5互作。综上所述,在油菜中超表达Os PGIP2能显著增强甘蓝型油菜的苗期和成株期菌核病抗性,而不损害种子的千粒重和品质性状。Os PGIP2转基因家系的叶提取物能延迟病原菌侵染,从而增强其对核盘菌的抗性。组成型表达Os PGIP2可增加活性氧的产生,提高茎秆细胞壁纤维素、半纤维素和甘露醇的含量,并影响油菜先天免疫反应相关基因的表达。同时,Os PGIP2蛋白能与核盘菌Ss PG3和Ss PG6发生互作,表明Os PGIP2在转基因甘蓝型油菜防卫反应机制中起着重要作用。