论文部分内容阅读
禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的一种常见的局部或全身性感染的细菌性传染病,包括大肠杆菌性肉芽肿、腹膜炎、输卵管炎、脐炎、滑膜炎、气囊炎、眼炎、卵黄性腹膜炎等疾病,随着集约化养禽业的发展,给养禽业带来严重的经济损失。荚膜多糖是禽致病性大肠杆菌的重要的致病因了,能够保护机体免受宿主免疫系统的侵害,neuC是荚膜多糖区域二的基因,neuC基因的缺失会使荚膜在合成方面产生缺陷。本研究利用λ-Red同源重组的方法构建了E058△neuC::cat、E058△neuC基因缺失突变株,同时将带有相应启动子的neuC全基因和完整的“意外转录本”插入表达载体pGEX-6P-1中,构建相应的回复株。PCR扩增出带有酶切位点的neuC基因并将其插入到pMD(?)19-Tsimple vector载体中,筛选出阳性重组子pMD-T-neuC,然后运用分子克隆方法将chlormycetin (cat)抗性基因插入到目的基因neuC中,构建出带有chlormycetin抗性基因质粒pMD-neuC-Cat。PCR扩增neuC-Cat,并电转入带有pKD46的禽病原性大肠杆菌分离株E058中,运用同源重组的方法,筛选出基因突变株E058△neuC::cat,然后将质粒pCP20电转入突变株E058△neuC::cat,去除chlormycetin抗性,筛选出无抗性突变株E058△neuC。体外生长曲线的测定表明,突变株E058△neuC::cat、E058△neuC的生长速度与亲本株相似,差异不明显。RT-PCR结果表明,在有抗性突变株E058△neuC::cat中,基因的缺失只影响该基因本身的表达,其上下游基因转录正常,而在去抗性突变株E058△neuC中,在上下游基因正常转录的情况下,我们发现去抗性后残余的片段竟然出现了转录,我们称之为“意外转录本”neuC’。12日龄SPF鸡胚的致死率试验中,亲本株E058的死亡率为90%,有抗性突变株E058△neuC::cat的死亡率为83.3%,无抗性突变株E058AneuC的死亡率86.7%,表明突变株较之亲本株毒力有一定的下降。1日龄SPF鸡致死试验结果说明,突变株较之野生株致病性高度致弱,无抗性突变株E058△neuC与有抗性突变株E058△neuC::cat相比致病性相对提高了。SPF鸡血清杀菌试验结果表明,突变株较之野生株毒力高度致弱；HD-11细胞吞噬试验表明,E058△neuC::cat与野生株相比抗吞噬能力高度致弱,但E058△neuC较之野生株差异不显著；在35日龄SPF鸡体内,与野生株E058相比,不管是有抗突变株E058△neuC::cat,还是无抗突变株E058△neuC,其在鸡体内的定居与持续实验均被高度致弱(P<0.001或P<0.0001),说明neuC基因与APEC的致病性相关联,同时我们将E058△neuC::cat、E058△neuC放在同一个动物模型中相互比较,发现相对于E058△neuC::cat, E058△neuC在攻毒鸡的肝.脾.肺和肾中的致病作用被显著放大(P<0.05),而携带这一意外转录本的E058△neuC::cat的回复株Re-E058△neuC::cat△neuC其致病性恢复到E058△neuC水平,上述结果显示,有抗性突变株E058△neuC::cat去除抗性后致病性放大的原因可能与意外转录子相关联,其致病性放大的分子机制还有待进一步研究。