论文部分内容阅读
从本实验室构建成功的RSBEST库中选择RSB0232EST(GenBankaccessionNo.:BM422826)进行BLASTn,获取人相关核苷酸序列;再根据该序列设计引物,以人睾丸CytotrapcDNA文库为模板进行PCR扩增,获得一条基因。在GenBank中有与该基因序列一致的一条推测基因(hypotheticgene)。将扩增得到的序列提交GenBank数据库后,得到登录号为AY640233,并命名为HSD-50。HSD-50基因ORF长948bp,包含6个外显子,位于chr2:227931949-228062777;其编码蛋白质由315aa组成,含有一个非常保守的Rhomboid结构域,有四个强的疏水区域;HSD-50蛋白等电点为8.3,分子量约36KDa。。
针对人多组织膜进行Northernblott杂交分析发现其为多组织表达,且睾丸组织高表达;构建了HSD-50蛋白质的原核表达载体,用HSD-50蛋白C端非保守区域100aa的多肽作为高纯度抗原肽免疫新西兰大白兔,制备了多克隆抗体。经ELISA测定抗体滴度达1∶32万;免疫组化结果显示,HSD-50主要在精原细胞胞浆中表达;被动免疫新西兰大白兔之后,动物的睾丸组织病理切片结果显示,多数曲细精管中精子细胞形成融合的巨细胞,有少数曲细精管中个别精原细胞、精母细胞出现核固缩现象,并且约10%各型细胞有脱落,曲细精管横切面可见生精细胞脱落后遗留的空隙。
酵母双杂交实验结果发现,HSD-50可与Bcl-2家族的促凋亡分子BIK相互作用;免疫共沉淀实验也进一步证明了这两个蛋白质之间的相互作用;免疫荧光实验结果显示,HSD-50和BIK之间存在较好的共定位现象。
HSD-50蛋白包含的Rhomboid结构域是一个特殊的丝氨酸蛋白酶结构域,具有这个结构域的蛋白质组成了一个蛋白家族,即Rhomboid家族,它们具有蛋白酶的活性,可以切割其特异的底物。在本研究中发现,外源性的HSD-50可以有效的降解外源性的BIK,当同时转染针对HSD-50有效的RNAi载体pSilencer-AB时,可以部分的抑制这个过程;这种降解过程具有时间依赖性,随着时间的增加,相同量HSD-50可以降解更多的BIK;也具有剂量依赖性,不同剂量的HSD-50,在相同时间内,对等量BIK的降解程度不同;这种降解过程对丝氨酸蛋白酶特异的抑制剂Aprotinin敏感,降解的过程可以被有效抑制;该过程不能被蛋白酶体抑制剂pS341抑制。
根据HSD-50蛋白和Rhomboid家族中的典型代表Rhomboid1进行比对,预测了发挥其丝氨酸蛋白酶活性的关键氨基酸:N44、G142、S144和H184;其中HSD-50蛋白的G(142)FS(144)GV结构高度同源于Rhomboid1蛋白中非常重要的结构G(215)AS(217)GG。针对这些预测,构建了一系列点突变N44、G142、S144和H184为A的突变体,同时缺失G142、S144和H184的突变体,以及只包括Rhomboid结构域的N端214aa的突变体和不包括Rhomboid的C端101aa的突变体;经过对这些突变体降解BIK的分析发现,点突变N44和H184并不影响HSD-50对BIK的降解活性;而单个点突变G142、S144后会降低其对BIK的降解活性,但当同时缺失G142和S144时,HSD-50对BIK的降解活性会严重降低;突变体214具有部分降解BIK的活性,而突变体101没有这种活性。
HEK293T细胞中有HSD-50和BIK的内源性表达,但是BIK的表达量非常低。蛋白酶体抑制剂pS341可以诱导内源性的BIK在HEK293T细胞中的积累。为了方便内源性BIK的检测,应用1μM的pS341诱导来构建BIK高表达模型,同时研究了HSD-50过表达和表达抑制时,内源性BIK在细胞中的含量变化。结果显示,过表达时,与对照相比BIK的含量有所降低;而当用RNAi抑制HSD-50的表达时,与对照相比BIK的含量明显增加。这个现象反映了在近似生理状态下,内源性的HSD-50也是可以降解内源性BIK的,这个过程可能是调节Bcl-2家族中促凋亡的分子BIK在细胞中水平的一种方式。实验中,同时检测了HSD-50是否会影响Bcl-2家族中的Bax和Bcl-2的表达,Westernblot分析结果显示:没有引起这两种蛋白质表达量的明显变化。
此外,HSD-50在HEK293T细胞中过表达时可以激活AP1信号通路,而当RNAi有效抑制内源性HSD-50的表达时可以逆转这种现象。
此外,在学习期间尚部分完成了一些其它实验。例如,完成了863任务中人睾丸四种新基因:HSD-33、HSD-34、HSD-35和HSD-36的原核表达,并制备了多克隆抗体;筛选得到一个可能的精子抗原HSD-35,免疫荧光结果显示该蛋白在人成熟精子的尾部表达;克隆了HSD-50的小鼠同源基因MSD-50,并设计合成了针对MSD-50的有效的SiRNA;从人睾丸组织中克隆得到一个Golgi体特异表达蛋白质DHHC1,构建成功真核表达载体,并进行了免疫荧光定位实验,结果显示:其GFP-DHHC1的荧光特征非常相似于Golgi体的荧光特征。为进一步研究奠定了基础。