目的周期麻痹性副肌强直是由位于17q23染色体上编码成人骨骼肌钠通道的α亚单位(SCN4A)基因发生突变所致,对患者的日常生活有严重的影响。早期正确的作出诊断,及时进行临床干预可减少、减轻发病,并可降低致残率。本研究通过对一个周期麻痹性副肌强直的中国家系进行详尽、细致的临床分析及分子生物学研究,旨在对该病的诊断提供方法和依据,并从临床及细胞水平对其治疗进行探讨。对象与方法(一)对象所有被检人员均来自一个四代中有十五人患有严重的周期麻痹性副肌强直的中国家系,为常染色体显性遗传,外显率完全。(二)研究方法1、临床研究(1)实验室检查对家系中部分成员进行血、尿、便常规,肝、肾功能,甲功及下丘脑-垂体-肾上腺轴检查。对部分患者发作期、发作后一周内、发作间期检测血钾和肌酶水平,并于发作期口服乙酰唑胺前、后24h分别检测尿肌酸水平。(2)HE染色和电镜观察对部分患者于发作间期对腓肠肌进行活检。分别行HE染色及投射电镜下超微结构观察。(3)电生理检查对部分患者进行常规肌电图检查、运动和冷水试验。(4)统计学分析对患者的临床资料分别进行组间t检验和相关性分析。比较发病年龄、发作频率和发展为PM时年龄的性别差异,检验发病年龄与发作频率和预后的相关性。检验水准α=0.05。2、基因诊断(1)引物设计与合成应用primer3软件自行设计SCN4A基因第13、19、23和24外显子特异性引物(2)基因组DNA提取应用常规饱和酚—酚氯仿方法提取血白细胞中DNA,经紫外分光光度计检测DNA纯度。(3)PCR分别以提取基因组DNA为模板,扩增上述标本基因组中的SCN4A基因第13、19、23和24部分外显子。(4)PCR产物检测以1.5%琼脂糖凝胶对扩增产物进行鉴定。(5)单链构(?)多态性(SSCP)银染系统检测PCR产物突变(6)测序将疑有突变的样品提纯,用ABI PRISMIN 3700DNA测序仪测序。结果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast检测是否发生氨基酸序列改变并定位。3、治疗(1)骨骼肌细胞原代培养取分别取病人和正常人腓肠肌,采用原代组织块培养法进行培养,倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况。(2)骨骼肌细胞免疫细胞化学染色取培养10d的成肌细胞接种生长载玻片,用常规SP染色方法进行Desmin的检测。(3)对病人骨骼肌细胞进行bFGF干预取对数生长期的原代病人组肌细胞接种于96孔板中,并分为3组:对照组(加细胞及培养液)、浓度组(加细胞培养液及8个浓度的bFGF)、空白调零组(不加细胞只加培养液)。孵育2天,换10%FBS的培基培养48h以使细胞同步化于G0期,然后用不同浓度bFGF的无血清培基继续培养72h。①用MTT法检测骨骼肌细胞增殖②骨骼肌细胞乳酸脱氢酶、肌酸激酶活性的测定③采用考马斯亮蓝比色法测定细胞蛋白质含量④统计学处理数据采用均数±标准差表示,利用SPSS10.0统计软件分析,多组间参数比较采用S.N.K多重比较法进行方差分析。结果(一)所有受试者中一个患者发作期血清钾高于正常水平,其他患者发作期均于正常范围,但较发作前有所升高。所有不伴PM的患者每次发作后血CK水平均增高,72h达高峰,以后逐渐降至正常。PM患者血CK持续高于正常水平一倍左右。患者口服乙酰唑胺后24h尿肌酸水平下降。(二)肌肉活检显示PM患者受累骨骼肌呈空泡样退行性改变。(三)所有受试患者发作间期肌电图均可见强直放电,皮温下降后强直放电发放频率明显增大力收缩后反转密度下降。PM患者可见正锐波、运动电位时限缩短。所有受试总者神经传导速度均正常。发作期插入电位延长,可见强直放电,随意运动时动作电位的数量、时限减少,波幅降低、波形离散,且与肌无力程度相一致。(四)受试患者运动试验运动后CMAP振幅下降均大于40%。冷水试验皮温下降后振幅下降幅度均大于常温下运动试验。(五)发病年龄、频率和发展为PM时的年龄在性别上均无显著性差异(P＞0.05),发病年龄与预后无关(r=0.2058,t=0.7285,P=0.48),发作频率和预后呈正相关(P＜0.05)。(六)所有受试患者SCN4A基因第24外显子4774bp处出现了套峰,为A/G。引起序列变化都是由AACATGTA→AACGTGTA,导致所编码的中性疏水氨基酸蛋氨酸被另一疏水的缬氨酸所替代(Met1592Val)。(七)骨骼肌细胞可体外培养,生长过程为3个阶段:迟滞期、分裂增殖期和肌管形成期,与在体发生过程相似。(八)病人组肌细胞培养初期生长明显慢于正常组,肌细胞大小不均,2周左右开始细胞旺盛生长、有肌管形成,但肌管的形成时间明显迟于正常组,形成数目极少。(九)bFGF对肌细胞生长的作用呈明显的浓度依赖性,浓度为120mg/ml时作用最大,此时浓度再增大其效应反而下降,160mg/ml时作用大于80mg/ml,但无统计学意义(P＞0.05),余各浓度组间有显著性差异(P＞0.01)。(十)体外培养的肌病细胞LDH活性和CK活性及蛋白质合成呈明显的bFGF浓度依赖性增高,与对照组相比各组浓度均有显著性差异(P＜0.01),160mg/ml时作用下降,但与80mg/ml组无差异(P＞0.05)。余各浓度组存在差异(P＜0.05)。结论(一)减少发作次数、减轻发作严重程度及避免劳累是预防PM切实有效的途径。(二)运动试验和冷水试验是周期麻痹简单、可靠、易行的临床诊断方法。根据其分类还可缩小热点基因的筛查范围,指导基因诊断。(三)发病年龄、发作频率和发展为PM时的年龄与性别无关;发病年龄与预后无关;发作频率越高发展为肌病的年龄越小,肌病越重。(四)SCN4A Met1592Val是正常血钾性周期麻痹中国人的热点基因。对于伴PM的周期麻痹患者,Thr704Met、Met1592Val应作为重点筛查位点。(五)正常血钾性周期麻痹和高钾性周期麻痹并非两个独立的疾病,而是同一种疾病的不同表现形式。(六)对于该病基因并非决定疾病发展方向的唯一因素,适时正确的临床干预可阻止疾病恶化、进展。(七)PM患者受损肌肉体外有一定的再生能力,但融合成肌管能力极弱,存在再生障碍,不能对变性、坏死的肌纤维形成有效再生,故呈进行性肌纤维耗竭过程。(八)外源性bFGF可促进PM患者体外培养骨骼肌细胞增殖分裂,并可促进肌管成熟,对进展性肌病应具有防治作用。(九)正常骨骼肌细胞可体外培养,生长过程与在体发生过程相似。而肌病组骨骼肌细胞存在明显的再生能力障碍,临床上PM并非全身广泛受累,根据这些特性PM患者自体正常细胞移植是可行的。