加米霉素(Gamithromycin)为一种新型半合成大环内酯类抗生素,由其制成的加米霉素注射液在国外已获准上市销售,临床用于治疗由溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、睡眠嗜组织菌和牛支原体引起的牛呼吸系统疾病。近期国内亦成功仿制出加米霉素及加米霉素注射液,临床药效研究表明国产加米霉素注射液单剂量皮下注射6mg/kg b.w对多杀性巴氏杆菌所致牛呼吸道感染同样具有良好的疗效。为进一步评价国产加米霉素注射液在牛体内的残留消除情况。本文建立了牛可食性组织中加米霉素残留量的检测方法,并在此基础上对国产加米霉素注射液在牛体内的残留消除进行了研究。研究结果不仅将为国产加米霉素注射液上市后残留的监控提供技术支撑,而且可为其休药期的制定提供依据,对临床合理用药和保障动物源性食品安全均具有重要意义。1、牛可食性组织中加米霉素残留量的测定——液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)牛可食性组织中加米霉素残留采用乙腈提取,正己烷除脂,Oasis MCX(?)萃取小柱净化。提取的样品使用Sun Fire C18色谱柱分离,柱温50℃,进样量1μL,流动相为甲醇-001 mol/L的乙酸铵缓冲液(pH:3.6)(70:30 v/v)。定量离子对为777.7>619.108,定性离子对为777.7>619.108和777.7>157.768。电喷雾电压5.5 kV,离子化温度500℃；正离子扫描,多反应检测模式。牛可食性组织中加米霉素添加浓度在6～1000ng/mL范围内线性良好,R2>0.99。空白肌肉和肝脏组织添加水平在6、200和800μg/kg时,平均回收率在84.17%-94.17%之间。空白肾脏组织添加水平在6、100和800μg/kg时,平均回收率在79.23%～90.36%之间。空白脂肪组织添加水平在6、20和800μg/kg时,平均回收率在84.91%-97.73%之间。上述空白组织添加样品的批间和批内变异系数均在10%以内。检测限为2 μg/kg,定量限为6μg/kg。方法学研究中稳定性试验分别考察了上样液在分析室中(约22℃)的稳定性、空白组织添加样品在循环冻融(22℃/-20℃)后以及-20℃下储存期间的稳定性。另外还考察了基质稀释效应对测定结果准确度的影响。结果表明,加米霉素在牛可食性组织中稳定性良好,变异系数在15%以内,高浓度的空白基质添加加米霉素采用空白基质稀释100、50、20倍后与对应浓度的空白基质添加相比,变异系数在15%左右,亦在可接受范围之内。2、加米霉素注射液在肉牛体内残留消除研究20头荷斯坦肉用小公牛(250～400 kg)用于加米霉素注射液的体内残留消除研究。将加米霉素注射液按临床推荐剂量(6 mg/kg b.w)给牛单次皮下注射,给药后分别于第10 d、20 d、30 d、45 d和60 d时各随机宰杀4头牛。受试牛处死后分别各采集背最长肌、脂肪、肾脏、肝脏以及注射部位皮下的肌肉组织样品适量。样品采集后不经任何处理,立即包装并做好标记,于-20℃以下保存供加米霉素残留量的测定。牛可食性组织中加米霉素残留量采用经验证的HPLC-MS/MS检测方法测定。结果表明,停药后第10 d时除注射部位皮下的肌肉组织外肝脏中加米霉素残留量最高,平均残留量为2483.98±196.75 μg/kg,其次是肾脏组织,平均残留量为2183.0±431.25 gg/kg,背最长肌和脂肪组织中残留量则较低,平均残留量分别为55.76±10.70μg/kg 和 30.66±10.31 μg/kg。停药第10 d时仅一头牛脂肪组织中加米霉素的残留量低于欧盟规定的残留限量标准,至停药第20 d时,加米霉素在4头牛的脂肪组织中残留量均低于欧盟规定的限量标准。至停药第30 d时,除2头牛的肝脏组织中加米霉素的残留量仍高于欧盟规定的限量标准外,其他可食性组织中加米霉素的残留量均低于限量标准；至停药第45d时肝脏、肾脏及脂肪中加米霉素的残留水平均低于欧盟规定的最高残留限量标准。残留消除试验结果表明,肝脏是加米霉素在牛体内残留的靶组织。依据欧盟规定的加米霉素在肉牛和非泌乳奶牛可食性组织中的残留限量标准,经休药期软件WT1.4计算,国产加米霉素注射液按推荐剂量给药,停药后加米霉素在牛的肝脏、脂肪和肾脏的休药期分别为39.54 d、30 d和33.13 d。综合残留消除试验结果,国产加米霉素注射液按推荐剂量单剂量牛颈部皮下注射,建议休药期可暂定为40 d。