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背景胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)是消化系统最常见的间叶源性肿瘤,占胃肠道肿瘤的1%-4%。在人群中,GIST的发病率约为1/10万-2/10万人,近年来呈明显增加趋势。目前多认为GIST起源于胃肠道起搏细胞Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)或其前体细胞。大部分GIST的发生与C-Kit(85%)和PDGFRA (10%)基因发生功能获得性突变有关。手术切除是GIST首选的治疗方式,但术后肿瘤复发转移率高达55%～90%,不能切除者中位生存期小于12个月,传统的放化疗对GIST基本无效。小分子酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(imatinib)靶向作用于KIT和PDGFRA治疗转移性和复发性GIST已取得明显疗效,但是只有小于3%的患者能够获得完全缓解。大约50%的患者在伊马替尼初始治疗2年内发生继发性耐药,耐药患者中位生存期仅为15个月。另一方面,野生型和PDGFRA D842V突变的GIST对伊马替尼治疗不敏感。因此,单靠KIT抑制剂不能治愈GIST。深入探索GIST耐药机制,寻找新的靶向治疗方案迫在眉睫。ETS家族是最大的信号依赖转录调控因子家族之一,其过度表达和许多人类肿瘤发生有关,近年来已成为各国学者关注的重点。现已发现30多个ETS家族成员,它们均含有一个由85个氨基酸组成的特异DNA结合区(ETS区),该区与靶基因启动区一个富含嘌呤的序列GGAA/T结合后调节基因转录。通过调节细胞的增生、分化、凋亡及上皮-间质相互作用,ETS家族蛋白参与许多生理和病理过程。ETS变异体1(ETV1, ER81)是ETS家族成员之一,在染色体上定位为7p21.3。已有研究表明,ETV1在乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、尤文氏瘤中过度表达,参与肿瘤的形成和发展。Chi P等研究发现ETV1是GIST起源细胞存活的特异因子,在GIST细胞中存在异常表达,且ETV1在GIST中的表达水平明显高于其他肿瘤,包括胃癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌等。并且ETV1能够与KIT协同作用,调控GIST细胞的增殖凋亡与恶性转变。若能进一步证实ETV1调控GIST的致瘤转化,那么靶向ETV1或ETV1相关信号治疗将能够解决GIST的imatinib耐药问题,成为GIST分子靶向治疗的一大突破。目的检测ETV1在胃肠道间质瘤组织和胃肠道间质瘤细胞系(GIST882)中的表达,分析GIST及对应瘤旁正常组织ETV1的表达差异,探究其与KIT表达、临床病理特征及危险程度分级的相互关系。通过体外合成siRNA干扰ETV1表达,观察ETV1对GIST882细胞增殖能力的影响及其与细胞周期、凋亡的关系。探讨ETV1影响胃肠道间质瘤发生发展的可能分子机制。方法1、运用实时荧光定量PCR技术和-Western Blot法检测72对新鲜胃肠道间质瘤及其瘤旁正常组织、胃肠道间质瘤细胞系(GIST882)中ETV1基因和蛋白水平的表达。运用免疫组织化学的方法检测胃肠道间质瘤组织芯片(156例标本)ETVI的分布和表达强度。分析ETV1的表达与胃肠道间质瘤临床病理特征的相互关系。2、利用化学合成的siRNA瞬时转染法转转染胃肠道间质瘤(GIST882)细胞,下调ETV1的表达,采用qRT-PCR法、Western blot法检测ETV1表达变化。根据基因沉默效率进行筛选、并确定其中一条siRNA作为后续研究使用。通过细胞增殖检测试剂盒CCK-8检测ETV1下调对GIST882细胞增殖能力的影响,通过流式细胞仪检测ETV1下调对细胞周期和凋亡的影响。3、通过Western Blot法检测上述转染细胞中Ras/Raf/MEK/ERK等相关信号分子的表达。结果本实验共收集72例胃肠道间质瘤手术切除新鲜标本。Western Blot和荧光定量PCR的结果显示ETV1及KIT在GIST肿瘤组织中高度表达,而在正常瘤旁组织和其他类型的肉瘤组织中均无表达,差异具有统计学意义(P<0.01)。胃肠道间质瘤细胞系(GIST882细胞)呈强ETV1表达。组织芯片(含156例标本)的结果与组织标本、细胞结果一致,表现为ETV1在间质瘤组织中呈广泛散在的细胞核表达。研究发现,ETV1在胃GIST中的表达较为多见,与年龄、性别等无关(P>0.05)。同时,ETV1的表达与KIT表达密切相关,差异有显著性(P<0.05),从不同危险程度分级上看,ETV1在低中危GIST的表达略低于KIT,但是在高危组明显高于KIT表达。利用瞬时转染分别转入3条ETV1siRNA, qRT-PCR法检测各组转染24h、48h、72h后ETV1mRNA水平变化。三条序列三个时间段的抑制率分别为：siRNA-A57.4%、63.0%、78.4%；siRNA-B37.5%、52.7%、65.5%；siRNA-C296%、46.1%、55.7%,较对照组mRNA表达显著下调(P<0.05)。抑制效率以siRNA-A序列转染72h最佳。Western blot进一步证实siRNA-A能较好沉默ETV1蛋白表达,故选择siRNA-A组进行后续试验。CCK-8增殖实验结果显示：ETV1表达下调抑制GIST882细胞的增殖(P<0.05)。细胞周期结果提示：ETV1表达下降后,GO-G1期比例上升,S期比例下降,与Control组和Negative组相比具有明显差异。流式细胞仪检测结果显示ETV1表达下调促进GIST882细胞的凋亡,而Negtive组和Control组之间无显著性差异。通过western blot检测转染siRNA下调ETV1表达后Ras、p-c-Raf、p-MEK、p-ERK的表达水平明显受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.01)。但是总的c-Raf、MEK、ERK没有明显的改变。结论ETV1在胃肠道间质瘤组织、胃肠道间质瘤细胞系(GIST882细胞)中普遍高表达。siRNA沉默ETV1基因能够显著抑制GIST882细胞的增殖,阻滞细胞周期进程,促进细胞的凋亡。沉默ETV1基因后,Ras、p-c-Raf、p-MEK、p-ERK的表达水平明显受到抑制,ETV1可能参与Ras/Raf/MEK/ERK的增殖信号环路来调控间质瘤的致瘤转化。