T细胞,也称为T淋巴细胞,是免疫系统的重要组成部分。T细胞能够通过淋巴和血液循环分布到全身组织器官,构成广泛存在的免疫监控网络,在适应性免疫应答中发挥重要作用。T细胞对抗原的识别依赖于高度多态性的表面受体的表达,这种受体称为T细胞受体（TCR）。TCRs具有细胞特异性,一个细胞只表达一种TCR。目前人们越来越意识到T细胞库并不是均匀分布在各组织器官,一些T细胞会驻留在肠道、皮肤等屏障组织中不再参与系统循环。然而,尚不清楚高度多样化的TCR库在组织器官是如何空间分布,不同组织中的TCR库多样性是否存在差异,组织中的TCRs是否在个体之间普遍共享,以及单个T细胞克隆的分化命运如何等科学问题。因此,本论文针对上述问题进行了以下方面的研究工作。通过高通量T细胞受体库深度测序技术TCRseq分析了健康野生型C57BL/6小鼠的16个组织部位的CD3+T细胞（细胞数约为5×10~5个）的TCR库。相似性聚类分析可见外周TCR库分布在三个相对独立的区域:淋巴结相关区域,血液相关的非淋巴结区域和肠道区域。与淋巴结和血液相关的非淋巴结组织相比,肠道组织的TCR库分布更不均匀且多样性更低。然而,TRBV和TRBJ基因使用,以及CDR3长度分布在各个组织区域间没有显著性差异。对鼠间克隆型共享情况的分析表明,虽然在淋巴结中更容易发现非冗余的公共克隆型,但在小肠组织中,特别是在小肠CD4+T细胞库中含有更高比例的公共克隆型。针对传统TCRseq技术存在构库偏差问题,我们开发了一种基于多重PCR方法的掺入两种外参的T细胞受体测序技术（Two spike-in T cell receptor sequencing,TS-TCRseq）。TS-TCRseq技术能够通过掺入带有条形码的质粒模板和T细胞杂交瘤对PCR扩增偏倚和测序错误校正及样本间测序深度标准化,此外还能够准确估算样本中的T细胞数量。该技术不仅适用于细胞样本,也适用于实体组织样本的TCR序列分析。利用TS-TCRseq技术,我们发现细胞分离方法会低估组织中的T细胞数量。在细胞分离过程中,组织中大部分高频T细胞克隆得到了保留,但是一些低频的稀有T细胞克隆会丢失。为了更全面和准确地了解生物体组织器官的TCR库,我们利用TS-TCRseq技术分析了健康野生型C57BL/6小鼠中30个组织的TCR序列信息。发现整个生物体30个组织的T细胞总数大约有1.0×10~8个,TCR库的克隆型多样性高达4.4×10~6种,且不同组织间的克隆型多样性差异很大。TCR序列相似性聚类分析观察到外周TCR库呈现明显的区域分布特征。进一步观察到19个组织的CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR库具有相似的组织器官分布规律和多样性特征。基于肺、肝脏和肾脏组织的CD8+T细胞具有较高的TCR序列相似性,我们联合使用scRNAseq和scTCRseq技术对健康野生型C57BL/6小鼠肺、肝脏、肾脏和脾脏中成对单细胞基因表达谱和TCR克隆型分析,结果确定了组织之间共享TCR的CD8+T细胞主要是效应记忆样T细胞,但同时存在一定的基因表达差异。随后通过拟时间轨迹分析揭示了单个T细胞克隆在不同组织的差异性分化状态,其中高表达Klrg1和Cx3cr1的肺组织来源T细胞处于轨迹开始,表示T细胞的最初状态;而高表达Cd69和Cxcr6的肾脏来源T细胞则占据了末端,标志着T细胞的最终命运。通过评估细胞发育过程中显著性基因集（通路）的TIPS方法阐明了趋化因子受体驱动的T细胞克隆在组织差异性分化的相关机制。综上所述,本论文通过传统TCRseq技术和开发的TS-TCRseq技术,结合生物信息学分析手段,全面分析了健康小鼠外周组织器官中TCR库的空间分布规律和多样性特征。联合利用scRNAseq和scTCRseq进行成对单细胞基因表达谱和TCR分析,进一步确定了不同组织间共享TCR的CD8+T细胞的转录谱特征主要是Tems,但也存在趋化因子受体驱动的T细胞克隆组织差异性分化。在健康生理条件下的这些研究结果提供了一个重要的参考数据集,有助于更好地研究T细胞对病原体感染和疫苗接种的免疫应答反应。同时,我们的研究结果有助于理解组织器官区域免疫系统防御机制,而且为将来研究组织器官相关的自身免疫性疾病和肿瘤免疫特征的研究奠定基础。