副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是定殖在猪上呼吸道中的常在菌群组成之一,同时也是引起猪Glasser氏病的病原体,该病在临床上以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征。目前,世界各主要养猪国家和地区都有关于该病流行和暴发的报道。随着养殖管理方式的转变,这些包括早期断奶技术的广泛推广使用和建立无特定病原体猪群等,使HPS成为影响当前养猪业最重要的细菌性病原的原因之一。由于兽医临床上表型差异菌株广泛存在,尤其是对不同毒力表型菌株差异的本质认识不足,关于HPS毒力相关因子,HPS感染宿主过程中如何发挥致病作用以及病原宿主相互作用的分子基础等知之甚少。因此,迫切需要破译副猪嗜血杆菌的全套遗传物质,为进行副猪嗜血杆菌功能基因研究开辟道路。以本实验室分离鉴定的副猪嗜血杆菌为主要研究材料,以我国流行的优势血清5型菌株SH0165为亲本株,通过对其完成全基因组测序,系统分析了副猪嗜血杆菌的毒力相关基因组成、体内感染过程中应激基因变化规律以及可能毒力表型遗传演化规律。具体工作如下:1.副猪嗜血杆菌基因分型及基因组测序菌株筛选为了筛选副猪嗜血杆菌测序菌株,从我国不同地区分离鉴定的副猪嗜血杆菌菌株中选取具有代表性的17株,与17株国际标准血清型参考菌株进行遗传进化分析,利用18个保守基因的串联序列构建系统进化发生树,结果表明副猪嗜血杆菌菌群至少可以分为2个基因型,我国的流行菌株大多属于基因A型中,同时分析鉴定了两个潜在区分强弱毒力菌株的分子靶标——ompP2和sodA基因。从基因A型中挑选生物学背景清楚的我国流行血清5型SH0165菌株作为副猪嗜血杆菌全基因组测序的强毒株。2.副猪嗜血杆菌SH0165菌株的全基因组测序分析通过“鸟枪法”测序策略,利用20,102条测序reads先后三轮拼接完成第一株副猪嗜血杆菌全基因组,之后通过酶切和long PCR方法确证SH0165基因组框架的正确性。全基因组分析结果表明SH0165基因组由2,269,156个核苷酸组成一个环状染色体,G+C%含量为39.99%,编码2299个基因。在SH0165基因组进行基因注释的基础上,系统的对基因的功能分类、编码蛋白特征、代谢途径中基因组成、噬菌体相关基因、转运相关基因、假基因以及信号转导和调控相关基因进行分析总结。3.副猪嗜血杆菌SH0165菌株潜在毒力因子分析利用8株已完成嗜血杆菌属全基因组序列,通过比较不同菌种菌株的毒力因子进行同源分析,同时参考Pubmed数据库中嗜血杆菌属毒力基因的研究文献,第一次系统总结副猪嗜血杆菌不同功能分类的毒力相关基因。通过SH0165基因组预测的全套毒力相关基因在体内感染以及体外模拟感染条件下差异表达基因规律的分析,总结出18个主要的毒力相关基因或操纵子基因,并通过PCR筛查分析发现,以上18个毒力相关基因或操纵子基因在我国流行菌株中高度保守,推测这些毒力因子可能是毒力菌株发挥致病作用的关键因子。4.副猪嗜血杆菌SH0165体内感染应激基因分析利用新一代测序技术——Illumina Solexa,对体内感染条件下(脑组织和肺组织中)副猪嗜血杆菌转录组分析,结果发现在脑组织中特异性的有2个的噬菌体岛的相关基因表达显著上调,并推测噬菌体携带的基因可能是副猪嗜血杆菌参与脑组织感染的效应因子。两种情况下共同诱导上调表达的基因一共305个,这些基因主要参与核苷酸生物合成、能量产生与转化途径以及抗氧化相关,推测感染过程中副猪嗜血杆菌通过提高自身合成与能量代谢效率实现增殖,同时通过操控自身抗氧化基因的上调表达逃逸宿主氧化危机。提示核苷酸生物合成以及能量合成与转化途径中的关键酶类具有开发成为抗副猪嗜血杆菌感染靶标的潜力。5.副猪嗜血杆菌毒力表型进化规律分析利用已知的20株巴氏杆菌科基因组序列,通过16S rDNA和35个保守基因构建系统发生树以及基因组同源基因作图分析,结果发现巴斯德菌科菌种存在两个进化分支,副猪嗜血杆菌与胸膜肺炎放线杆菌遗传进化上最接近,而与嗜血杆菌属其他成员亲缘关系较远,证实副猪嗜血杆菌分类上独立于嗜血杆菌属之外形成一个相对独特的进化分支。通过比较该科成员中致病菌株与非致病菌株基因组,结果发现该菌科成员存在的基因组减少进化规律,比较29755与SH0165基因组发现,两株副猪嗜血杆菌的差异主要在噬菌体基因组成和数量上。结合SH0165基因组特点,推测噬菌体介导的外源毒力相关基因的水平转移和宿主菌功能基因的丢失(形成较多假基因)导致SH0165菌株经历一个基因组快速变化阶段,而这一过程可能是低致病力的副猪嗜血杆菌快速进化成为高致病菌株的一个重要原因。