论文部分内容阅读
第一部分 日本大耳兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及诱导分化目的:体外分离、培养、鉴定兔的骨髓间充质干细胞(MSCs),选择增殖分化能力最佳的MSCs作为移植实验用MSCs。方法:采用健康幼龄日本大耳兔,麻醉值死后冲洗骨髓收集骨髓液,采用密度梯度离心和贴壁培养法分离、提取和扩增MSCs,在显微镜下观察MSCs的形态变化和生长情况,同时收集第三代(P3)细胞,用流式细胞仪检测其CD34、CD44、 CD45、CD904种表面标志抗原。ALP染色及油红染色鉴定其向成骨细胞和成脂肪细胞多向分化的能力。结果:第3代后的MSCs生长呈长梭形、成纤维状,密度分布均匀;第3代MSCs经流式细胞检测显示CD34(-)、CD45(-)、CD44(+)、CD90(+),符合MSCs的表面抗原。MSCs成骨和成脂诱导后用ALP及油红O染色为阳性,细胞由长梭形变为多边形。结论:通过密度梯度离心和直接贴壁培养相结合的方法可获得纯度较高的兔MSCs,分离培养的MSCs具有间充质干细胞的表面标志抗原,能诱导分化为骨和脂肪细胞。第二部分TGF-β基因慢病毒载体的构建目的:通过慢病毒载体系统对目的基因TGF-β1进行包装;方法:利用基因克隆技术将TGF-β1基因定向克隆至慢病毒载体,构建TGF-β1基因重组质粒,并进行PCR、酶切和测序鉴定。在脂质体LP2000的作用下转染293T细胞,从细胞培养液中收集富含的慢病毒颗粒,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,以实时荧光QPCR检测慢病毒滴度。结果:采用基因克隆技术构建的TGF-β1重组慢病毒经PCR、酶切及测序鉴定完全正确,转染293T细胞能够正确表达。结论:基因克隆技术能成功构建TGF-β1重组慢病毒载体,转染293T细胞后能够正确表达。第三部分TGF-β1基因转染MSCs并观察其在MSCs中的表达目的:用TGF-β1基因修饰MSCs,观察TGF-β1基因在MSCs内的表达对其增殖及分化的影响。方法:通过慢病毒感染预实验来确定合适M0I,并以合适的MOI感染兔MSCso荧光显微镜下观察TGF-β1蛋白表达情况及感染率,并以半定量RT-PCR及Wstern Blot检测感染后兔MSCs中TGF-β1 mRNA及Collagen Ⅱ的表达情况。观察转染后BMSCs细胞增殖能力和代谢能力。结果:滴度为1×108TU/ml慢病毒感染MSCs最佳MOI值为10, RT-PCR及Wstern Blot能检测感染后兔MSCs中TGF-β1 mRNA及Collagen Ⅱ的表达。结论:基因克隆技术构建的TGF-β1-pCDH-GFP融合基因重组慢病毒载体转染MSCs后,MSCs中TGF-β1和Collagen Ⅱ能高效表达,且MSCs代谢和增殖活性增强。