小皱蝽抗菌肽AMP的分离纯化和性质分析

来源 :西南农业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:guojade_2009
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抗生素作为临床上应用最广泛的药物,由于耐药菌株的出现和传播,已造成临床医学感染性疾病治疗上的严重困难。昆虫抗菌肽是一类分子量小、水溶性好、稳定、抗菌谱广且抗菌作用机制独特的阳离子多肽,可望成为新一代治疗药物。昆虫是生物界最大的生物类群,在自然界有极为广阔的生活空间和生存能力,不少科学家认为,昆虫具有惊人的天然免疫力,并以抗菌肽作为其宿主防御机制的主要成分。目前,已从双翅目、鳞翅目、膜翅目、鞘翅目、半翅目等各类昆虫纯化了170多个诱导抗菌肽分子,这些分子在结构和活性方面表现多样性。本文正是基于这些目的,用大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)诱导小皱蝽成虫,产生免疫防御反应,在小皱蝽体内出现抗菌活性很强的抗菌物质。我们从小皱蝽成虫体内提取并纯化了抗菌肽AMP,研究结果于下: 剖开小皱蝽成虫,昆虫生理盐水浸取,浸提液酸化后超速离心,上清液经Millipore超滤系统超滤,超滤穿膜液含有抗菌活性物质,为小皱蝽抗菌肽的粗提液,粗提液经Waters Sep-Pak C18 Cartridge固相萃取初分级分离,40%ACN Sep-Pak组分为含抗菌肽的级分,该样品为粗样品;粗样品在Aquapore OD300 C18 Column上进行RP-HPLC纯化,27%ACN的洗脱组分为活性峰,收集活性峰的样品在Superdex Peptide(7.5x300mm)凝胶过滤柱上高效液相色谱纯化,完成了小皱蝽抗菌肽AMP的中度纯化,实现进一步分离,得到的样品在Waters Symmetry 300 C18 Column(4.6×250mm)上纯化为色谱单峰,并用PE PepMap C18 Column(4.6×250mm;5m,300)检测AMP的纯度,AMP在短波紫外区(190-225nm)和280nm有强紫外吸收,茚三酮反应紫色,经凝胶过滤法测定抗菌肽分子量为6950Da。 性质分析表明,AMP热稳定性好,在近中性pH值(pH4-9)条件下抗菌活性强,AMP抗菌谱广,对典型菌株的MIC值很低,是有较好应用前景的抗菌肽分子。
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