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骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是关节软骨的退行性病变,软骨破坏是其主要的病理特点。骨关节炎严重影响患者的生活质量,同时给家庭和社会带来了巨大的经济负担。目前,NSAIDs(非甾类抗炎药)类药物是用于治疗OA最常用的处方药,虽然能够缓解患者的疼痛,但并不能抑制软骨破坏及延缓OA进程。中医药治疗OA具有疗效好、副作用小的优势。前期临床研究发现补肾壮骨法治疗OA疗效显著,总有效率为90%,能够改善患者关节疼痛、肿胀,改善关节功能；实验研究发现补肾壮骨法能够改善OA动物模型关节结构紊乱,抑制软骨细胞数量减少。因此,深入研究中医药抑制软骨破坏发挥软骨保护作用及其可能的分子机制是非常必要的。本课题在补肾壮骨法治疗OA的学术思想指导下,以国家自然基金为依托,以体外培养的人OA软骨细胞为研究对象,采用中药血清药理学,借助现代分子生物学技术,研究补肾壮骨法对细胞增殖、凋亡及基质代谢的影响。1实验研究一：人骨关节炎软骨细胞系建立与鉴定目的：建立人骨关节炎软骨细胞有限细胞系,观察其生长和形态特性,为进一步开展OA软骨细胞分解代解及药物发挥软骨保护作用相关领域的细胞分子生物学研究提供物质基础和实验模型。方法：在北医三院骨关节矫形中心协助下,取需作全膝关节置换手术的OA患者10例(女性,65-85岁),采用酶消化原代培养法建立人OA软骨细胞系。应用MTT比色法检测细胞增殖特性；采用甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原免疫组化鉴定细胞来源；倒置显微镜下观察细胞生长、形态变化。结果：成功建立了人骨关节炎软骨细胞有限细胞系,细胞生长状态良好,生物学性状稳定；甲苯胺蓝与Ⅱ型胶原免疫组化证明所培养的细胞为来自中胚层的软骨细胞。结论：本实验采用酶消化原代培养法,成功建立了生物学性状稳定的OA软骨细胞有限细胞系,经鉴定为中胚层来源的软骨细胞,为研究OA发病机制及药物干预细胞基质代谢作用提供了较好体外模型。2实验研究二：人骨关节炎软骨细胞增殖、细胞周期及凋亡研究目的：以正常人膝关节软骨细胞为对照,观察体外培养OA软骨细胞增殖、细胞周期及凋亡特征,研究OA软骨细胞的基本生物学特性。方法：在北医三院骨关节矫形中心协助下,取因外伤急性截肢患者的软骨组织以及全膝关节置换手术OA患者的软骨组织,采用酶消化培养法培养人软骨细胞。应用MTT比色法检测OA软骨细胞与正常软骨细胞的增殖特性；采用流式细胞术检测OA软骨细胞与正常软骨细胞周期特点与凋亡率的不同。结果：OA软骨细胞较正常软骨细胞表现为过度凋亡(P<0.01),S期细胞比例降低(P<0.05),且细胞增殖明显缓慢(P<0.01)。结论：在OA发病过程中,OA软骨细胞过度凋亡及增殖缓慢可能是加速OA软骨破坏的重要因素。3实验研究三：人骨关节炎软骨细胞IL-1β蛋白表达状况目的：以正常软骨细胞为对照,观察OA软骨细胞上清液中IL-1β(interleukin-1β)含量及软骨细胞IL-1β蛋白表达状况,探讨IL-1β在OA发生发展中的作用。方法：采用ELISA法比较OA软骨细胞和正常软骨细胞上清液中IL-1β的含量；采用Western blot技术检测OA软骨细胞和正常软骨细胞IL-1β蛋白表达情况。结果：OA软骨细胞较正常软骨细胞上清液中IL-1β含量增多(P<0.05),且IL-1β蛋白表达增强(P<0.01)。结论：细胞因子IL-1β在OA软骨破坏中发挥重要作用。IL-1β通过对MMPs(金属基质蛋白酶)的异常调控,促进软骨细胞分解代谓}；同时IL-1β可能通过诱导软骨细胞凋亡、发挥促炎作用,促进软骨破坏。4实验研究四：人骨关节炎软骨细胞金属基质蛋白酶蛋白表达状况目的：以正常软骨细胞为对照,观察OA软骨细胞MMPs(金属基质蛋白酶)蛋白表达状况,探讨MMPs在OA软骨破坏中的作用。方法：采用Western blot技术检测OA软骨细胞和正常软骨细胞MMP-1、3、13蛋白表达情况。结果：OA软骨细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白表达较正常软骨细胞明显增强(P<0.01)。结论：金属基质蛋白酶在OA发生发展中发挥重要作用,可通过降解细胞外基质,加速细胞外基质的分解代酣,导致OA软骨破坏的发生。5实验研究五：牛膝健步颗粒对人骨关节炎软骨细胞增殖及凋亡的影响目的：以正常软骨细胞为对照,探讨牛膝健步颗粒对体外培养OA软骨细胞增殖及凋亡的影响。方法：将软骨细胞分成正常软骨细胞组、OA软骨细胞组、OA软骨细胞组+对照血清组、OA软骨细胞组+含药血清小剂量组、OA软骨细胞组+含药血清中剂量组、OA软骨细胞组+含药血清大剂量组,根据分组情况培养细胞24h后,应用CCK-8法比较各组细胞增殖情况：应用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果：牛膝健步颗粒可明显促进OA软骨细胞增殖,抑制OA软骨细胞早期凋亡(P<0.01)。结论：牛膝健步颗粒抑制OA软骨细胞过度凋亡,促进细胞增殖,这可能是抑制OA软骨破坏的重要机制之一。6实验研究六：牛膝健步颗粒对人骨关节炎软骨细胞IL-1β蛋白表达的影响目的：以正常软骨细胞为对照,探讨牛膝健步颗粒对体外培养OA软骨维细胞IL-1β蛋白表达的影响,研究牛膝健步颗粒是否具有抑制OA软骨细胞细胞因子IL-1β的作用。方法：将软骨细胞分成正常软骨细胞组、OA软骨细胞组、OA软骨细胞组+对照血清组、OA软骨细胞组十含药血清小剂量组、OA软骨细胞组+含药血清中剂量组、OA软骨细胞组+含药血清大剂量组,根据分组情况培养细胞48h后,采用ELISA法比较各组细胞上清液中IL-1β的含量；采用Western blot技术检测各组细胞IL-1β蛋白表达情况。结果：牛膝健步颗粒可明显抑制细胞上清液中IL-1β含量(P<0.01),可明显抑制OA软骨细胞IL-1β蛋白表达(P<0.01)。结论：牛膝健步颗粒抑制软骨细胞分泌IL-1β,发挥抗炎作用；同时抑制IL-1β对MMPs的异常调控,抑制MMPs对细胞外基质的降解,从而抑制OA软骨破坏。7实验研究七：牛膝健步颗粒对人骨关节炎软骨细胞金属基质蛋白酶蛋白表达的影响目的：以正常软骨细胞为对照,观察牛膝健步颗粒含药血清对体外培养OA软骨维细胞MMPs表达的影响,探讨牛膝健步颗粒是否具有抑制OA软骨细胞MMPs的作用。方法：将软骨细胞分成正常软骨细胞组、OA软骨细胞组、OA软骨细胞组+对照血清组、OA软骨细胞组+含药血清小剂量组、OA软骨细胞组+含药血清中剂量组、OA软骨细胞组+含药血清大剂量组,根据分组情况培养细胞48h后,采用Western blot技术检测各组细胞MMP-1、3、13蛋白表达情况。结果：牛膝健步颗粒可明显抑制MMP-1、3、13的蛋白表达(P<0.01)。结论：牛膝健步颗粒抑制OA软骨细胞MMPs的表达,从而抑制MMPs对细胞外基质的降解,使细胞的合成代谢与分解代谢达到平衡状态,抑制OA软骨破坏。8实验研究八：淫羊藿苷对人骨关节炎软骨细胞增殖及凋亡的影响目的：以正常软骨细胞为对照,探讨淫羊藿苷对体外培养OA软骨细胞增殖及凋亡的影响。方法：将软骨细胞分成正常软骨细胞组、OA软骨细胞组、OA软骨细胞组+淫羊藿苷组,根据分组情况培养细胞48h后,应用CCK-8法比较各组细胞增殖情况；应用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果：淫羊藿苷可明显促进OA软骨细胞增殖(P<0.01),抑制OA软骨细胞早期凋亡(P<0.01)。结论：淫羊藿苷抑制OA软骨细胞过度凋亡,促进细胞增殖,这可能是抑制OA软骨破坏的重要机制之一。9实验研究九：淫羊藿苷对人骨关节炎软骨细胞IL-1p及金属基质蛋白酶表达的影响目的：以正常软骨细胞为对照,研究淫羊藿苷对体外培养OA软骨细胞细胞因子IL-1β及金属基质蛋白酶(MMPs)表达的影响,探讨淫羊藿苷是否具有抑制软骨细胞分解代谢,从而抑制软骨破坏的作用。方法：将软骨细胞分成正常软骨细胞组、OA软骨细胞组、OA软骨细胞组+淫羊藿苷组,根据分组情况培养细胞48h后,采用ELISA法比较各组细胞上清液中IL-1β的含量；采用Western blot技术检测各组细胞IL-1β、MMP-1、3、13蛋白表达情况。结果：淫羊藿苷能够抑制细胞上清液中IL-1β含量(P<0.05),且明显抑制IL-1β及MMP-1、3、13的蛋白表达(P<0.01)。结论：淫羊藿苷抑制软骨细胞分泌IL-1β,发挥抗炎作用；同时抑制IL-1β对MMPs的异常调控,抑制MMPs对细胞外基质的降解,从而抑制OA软骨破坏。