【摘 要】
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赭曲霉毒素A（OTA）是最重要的真菌毒素之一,主要由曲霉菌和青霉产生,对谷物和葡萄等多种作物及其发酵产品造成污染。最近OTA污染率增高,国际监控愈发严格,亟需一种有效的污染控制方法。在众多真菌毒素降解方法中,生物降解是一种有前途的、安全的、绿色的、高针对性的降解方法。然而,现有的OTA降解菌株存在降解效率低、降解产物不明确、在实际样品中应用较少等缺点。因此,本论文利用紫外辐照诱变黑曲霉获得了一株具
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赭曲霉毒素A（OTA）是最重要的真菌毒素之一,主要由曲霉菌和青霉产生,对谷物和葡萄等多种作物及其发酵产品造成污染。最近OTA污染率增高,国际监控愈发严格,亟需一种有效的污染控制方法。在众多真菌毒素降解方法中,生物降解是一种有前途的、安全的、绿色的、高针对性的降解方法。然而,现有的OTA降解菌株存在降解效率低、降解产物不明确、在实际样品中应用较少等缺点。因此,本论文利用紫外辐照诱变黑曲霉获得了一株具有较高OTA脱除率（74.49%）的突变菌株FS-UV-21。研究了该菌株对OTA的脱除效果,鉴定了OTA的降解产物并推测了OTA在菌株体内的代谢产物。初步评价了其代谢降解物的细胞毒性,并将黑曲霉FS-UV-21应用到麦麸的生物发酵中。最后综合分析了该菌株对OTA污染的防治效果与机制,为生物防治OTA的污染提供理论基础。具体研究内容如下:1.黑曲霉菌株FS-UV-21紫外线诱变筛选及鉴定。研究了菌株对OTA的脱除效果,发现FS-UV-21相较于原始菌株FS10,脱除率提升了18.89%。各组分脱除效果显示FS-UV-21孢子悬液与发酵液对OTA的脱除效果很差,菌丝体效果较好,可达到70%,且菌丝体对OTA具有一定的吸附作用。通过优化OTA的浓度、p H、温度及孢子接种浓度,黑曲霉FS-UV-21在p H为8,温度为30℃,孢子悬液浓度为1×10~3CFU/m L的条件下,42 h后对OTA的脱除率最高为89.36%。2.OTA生物降解产物及代谢过程研究及其安全性评价。通过UPLC-q-To F分析确定了黑曲霉FS-UV-21降解OTA的降解产物为OTα(C11H8Cl O5)。Q-Trap-MS检测并结合Light Sight TM软件分析推测出了3种相关的生物转化代谢产物,分别是P1(C19H18Cl NO6,m/z 404)、P2(C22H22Cl NO8,m/z 486)和P3(C19H16Cl NO7,m/z 416),其中P1很可能是OTA在黑曲霉体内通过去甲基加氧化产生的新代谢物。Hep G2细胞毒性实验表明OTA不仅显著影响Hep G2细胞的形态,还可导致细胞活性降低甚至死亡,而经黑曲霉FS-UV-21处理后OTA的代谢降解产物细胞的存活率上升了59.45%,细胞的氧化损伤也有所降低。3.降解菌株FS-UV-21生物发酵麦麸样品应用及其毒素脱除工艺优化。通过单因素实验确定麦麸发酵的4个因素（孢子悬液接种量、发酵温度、发酵时间和料水比）水平,响应面优化后可以得到最优脱除条件为孢子悬液（浓度为10~6CFU/m L）接种量15%,发酵温度32oC,发酵时间5 d,料水比1:3.3 g:m L,此条件下OTA脱除率为60.89%。对发酵前后挥发性物质的研究发现,不同于传统麦麸风味的挥发性化合物含量增加明显,如壬醇、香兰素等。因此,应用FS-UV-21发酵麦麸不仅能有效降低其中OTA的含量,还能提升麦麸的风味。4.黑曲霉FS-UV-21及其发酵产物对赭曲霉产毒菌A.ochraceus NRRL 3174生长及产毒能力的抑制作用分析及机制研究。在固体培养基中,黑曲霉FS-UV-21及其发酵产物能有效抑制赭曲霉的生长,并改变了赭曲霉孢子的形态,使其产生空隙。在液体培养基和小麦粒及麦麸基质中,黑曲霉FS-UV-21及其发酵产物不仅能抑制赭曲霉的生长,还能显著降低OTA的产量。黑曲霉FS-UV-21发酵液对赭曲霉的径向生长抑制率为59.1%。黑曲霉FS-UV-21对赭曲霉的机制机理包括竞争抑制和抑菌活性物质的产生。通过代谢组学分析,结果显示黑曲霉发酵液能显著影响赭曲霉多条与氨基酸代谢、苯丙氨酸合成相关的通路,很可能因此抑制赭曲霉的生长与产毒。总之,本文筛选获得可同时降解OTA毒素和抑制产毒的诱变降解菌株FS-UV-21,解析其降解产物变化路径及安全性,并应用于实际麦麸样品,获得较好的脱除效率。并且可有效抑制OTA产毒菌的生长和产毒,研究结果为麦麸等农产品中真菌毒素控制提供了有效的手段。
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