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[目的]研究沉默动脉粥样硬化(AtherosclerosisAS)患者巨噬细胞内Notchl、Notch2、Notch3基因后其对配体DLL4、JAG1以及NF-κB通路中亚基P65、P52、IκBα表达的影响,分析它们之间的关联性,从而探讨Notch和NF-κB信号通路在AS发病过程中可能的串话方式,为AS的预防和治疗提供新的理论依据。[方法]1.将AS患者外周血单核细胞诱导为巨噬细胞,并经流式细胞术进行细胞鉴定。将诱导成功的巨噬细胞分别经 Notchl-siRNA、Notch2-siRNA、Notch3-siRNA 以及 NC-siRNA转染,构建Notch低表达的siRNA-巨噬细胞模型,并对沉默效果进行评估。2.使用实时荧光定量 PCR(realtime Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)和免疫印迹试验(Western Blot)法检测转染后各组 DLL4、JAG1、NF-κB P65、NF-κB P52、IκBα 基因以及蛋白表达情况。3.采用凝胶迁移率实验(EMSA)检测转染组NF-κB的活性。4.采用免疫荧光法和生物荧光倒置显微镜观察沉默巨噬细胞中Notch基因后P65、P52亚基定位分布情况。[结果]1.RT-PCR 结果显示:siRNA 转染巨噬细胞后,Notch3-siRNA 组、Notch2-siRNA 组、Notch1-siRNA组中NF-κB P65、NF-κB P52基因表达水平渐次降低(分别为0.709±0.007、0.557±0.031、0.114±0.014;0.853±0.061、0.822±0.077、0.519±0.035),组间差异有统计学意义(P<0.01),且较空白及阴性对照组均出现明显下降(P<0.05或0.01),Nochl-siRNA组下降最显著;而IκBα表达水平渐次升高(分别为1.811±0.172、3.253±0.169、5.295±0.433),组间差异有统计学意义(P<0.01),并均明显高于空白、阴性对照组(P<0.05或0.01),也以 Noch1-siRNA 组变化最明显。同时 Notchl-siRNA 组、Notch2-siRNA 组、Notch3-siRNA组中 DLL4、JAG1 的基因表达水平(分别为 0.248±0.027、0.563±0.0178、0.782±0.058;0.296±0.026、0.495±0.016、0.655±0.048)较空白及阴性对照组均出现明显下降(P<0.01),组间差异具有统计学意义(P<0.01),以转染Notchl-siRNA组下降最明显。2.Western-Blot方法检测结果显示:转染巨噬细胞后,Notch3-siRNA组、Notch2-siRNA组、Notch1-siRNA组中DLL4、JAG1、NF-κB P65、NF-κB P52蛋白表达水平均渐次降低,组间差异有统计学意义(P<0.01),且较空白及阴性对照组均出现明显下降(P<0.05或0.01),Noch1-siRNA组下降最显著;而IκBα蛋白表达水平渐次升高,组间差异有统计学意义(P<0.01),并均明显高于空白、阴性对照组(P<0.05或0.01),也以Noch1-siRNA组变化最明显。3.EMSA法检测显示Notch-siRNA转染的各组巨噬细胞内NF-κB活性均明显低于空白对照组和阴性对照组,Notch1-siRNA组活性下降最显著。4.巨噬细胞核内P65、P52蛋白的荧光强度在Notch1-siRNA组(分别为21405±929、24 760±600)、Notch2-siRNA 组(分别为 25987±911、32 764±413)、Notch3-siRNA 组(分别为28074±452、44106±698)较空白对照组(57238±1059、50892± 1 200)以及阴性对照组(55844±1331、49700±856)均不同程度减弱(P<0.01),且细胞核内荧光强度较核外更低,以Notch1-siRNA组减弱最明显(组间比较P<0.01)。[结论]1 AS 患者巨噬细胞分别转染 Notch1-siRNA、Notch2-siRNA 以及 Notch3-siRNA 后,可在转录水平下调NF-κB功能亚基P65、P52的表达,上调NF-κB抑制因子IκBα的表达,抑制P65、P52蛋白向核内转移,同时还降低核蛋白NF-κB的DNA结合活性,从而影响下游基因的转录活性,最终导致NF-κB信号通路受到抑制。2 AS患者巨噬细胞中Notch1基因对NF-κB信号通路的调节作用较另两种(Notch2、Notch3)更为显著。3 AS患者巨噬细胞中Notch1、2、3基因沉默后,其配体DLL4、JAG1的表达在转录水平受到抑制,且以Notch1组抑制最显著。