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TRAF1属于TNF受体相关因子(TNFR-associated factor TRAF)家族。TRAF家族是一类胞内衔接蛋白,能介导TNF受体和IL-1受体超家族的信号转导引起NF-?B和JNK等的活化,从而对细胞的生存与死亡产生影响。TRAF1不具有TRAF家族其他成员所共有的环指和与之相邻的锌指结构,其可募集一些TNF受体超家族成员,包括TNFR2,CD30,CD27,TRANCE-R等。据报道,TRAF1可抵抗/抑制细胞凋亡:在转基因动物中过表达TRAF1,可抑制抗原诱导的CD8+细胞的凋亡;TRAF1可通过募集cIAP以执行其抗凋亡作用。但也有不同研究结果表明TRAF1可促进细胞凋亡。本室前期工作首次证实高表达TRAF1能与线粒体共定位并引起线粒体聚集,这一现象具有普遍性。而且转染TRAF1的HepG2细胞,其NF-κB活性增强,能抵抗TM-TNF-α的杀伤。转染TRAF1能上调线粒体融合蛋白Mfn2的mRNA水平,提示TRAF1引起的线粒体聚集可能与线粒体融合分子相关。本课题选取Hela细胞作为研究对象,借助Realtime-PCR观察高表达TRAF1线粒体融合蛋白Mfn1转录水平的变化;以化疗药物阿霉素诱导Hela细胞凋亡为模型,观察高表达TRAF1对于阿霉素杀伤作用的影响,并通过检测线粒体膜电位的变化、caspase-9的活化以及I?B的降解,进一步深入探讨TRAF1导致线粒体聚集的生物学效应及其分子机制。一.转染TRAF1使线粒体融合蛋白Mfn1的mRNA水平增高以Realtime-PCR分别观察Hela细胞各实验组:未转染组、转染空载体pDsRed组和转染pDsRed-TRAF1重组质粒组中线粒体融合蛋白Mfn1的mRNA水平的变化。转染TRAF1后,Mfn1分子的mRNA水平明显增高,为未转染组的2.18倍(P<0.01),为转染空载体组的2.48倍(P<0.01)。提示TRAF1可能通过上调Mfn1的表达而导致线粒体聚集。二.转染TRAF1可抵抗化疗药物阿霉素的杀伤效应以Hela细胞为靶细胞,设未转染组、转染空载体组和转染TRAF1组,以1μM阿霉素分别刺激各组细胞48小时,观察TRAF1对阿霉素杀伤Hela细胞的影响。MTT结果显示:转染TRAF1组表现为对阿霉素杀伤作用的抵抗,其杀伤率与未转染组和转染空载组相比,分别下降了18%和17.21% (P<0.05)。提示转染TRAF1可抵抗阿霉素对Hela细胞的杀伤效应。三.转染TRAF1可使线粒体发生聚集以阿霉素未刺激/刺激的Hela细胞为靶细胞,分别设未转染组,转染空载组和转染TRAF1组,1μM阿霉素刺激各组细胞24小时,在荧光显微镜油镜下观察阿霉素刺激前后TRAF1转染所导致的线粒体形态变化。阿霉素未刺激时,3组细胞线粒体结构均呈紧密的管网状结构细胞,而TRAF1转染组与未转染组和转染空载组相比,表现为线粒体聚集。阿霉素刺激后,未转染组与转染空载组线粒体结构松散紊乱,并有片段化的线粒体出现,而转染TRAF1组仍能保持聚集状态。四.转染TRAF1可增强线粒体膜电位稳定性以阿霉素未刺激/刺激的Hela细胞为靶细胞,分别设未转染组,转染空载组和转染TRAF1组,1μM阿霉素刺激各组细胞24小时,观察阿霉素刺激前后各组细胞线粒体膜电位的稳定性。结果显示:转染TRAF1组在阿霉素刺激前后,膜电位的稳定性均比未转染组和转染空载组增强。阿霉素刺激之前,TRAF1组凋亡细胞与对照组和空载组相比,分别下降了19.8%和21.8%;刺激后,TRAF1组凋亡细胞与对照组和空载组相比,分别下降了16.8%和14%。提示TRAF1能维持线粒体膜电位的稳定性。五.转染TRAF1可减少caspase-9的活化以阿霉素未刺激/刺激的Hela细胞为靶细胞,分别设未转染组,转染空载组和转染TRAF1组,1μM阿霉素刺激各组细胞24小时,通过Western blot观察阿霉素刺激前后各组细胞胞浆蛋白中caspase-9的活化。无论阿霉素刺激前后,转染TRAF1均可使caspase-9的活化明显减少。结合上述膜电位的结果,提示TRAF1可能通过抑制线粒体凋亡途径,提高线粒体膜电位的稳定性,减少caspase-9的活化而发挥其抵抗杀伤的作用。六.转染TRAF1可增加IκB的降解以阿霉素未刺激/刺激的Hela细胞为靶细胞,分别设未转染组,转染空载组和转染TRAF1组,1μM阿霉素刺激各组细胞24小时,观察阿霉素刺激前后各组细胞胞浆蛋白中IκB的降解。转染TRAF1后,IκB的降解增加,提示TRAF1可活化NF-κB,从而抵抗凋亡。结论:TRAF1可能通过增加线粒体融合蛋白Mfn1的表达而引起线粒体聚集,此种聚集所导致的生物学效应为抵抗细胞凋亡,表现为转染TRAF1可抵抗化疗药物阿霉素对Hela细胞的杀伤。其抵抗杀伤(凋亡)的机制之一可能是通过抑制凋亡线粒体途径:提高线粒体膜电位的稳定性、减少caspase-9的活化。另一方面,也可能通过NF-κB的活化而促进细胞生存。因此,TRAF1通过影响细胞的生存和死亡两方面的共同作用,最终发挥抵抗细胞凋亡的效应。