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稻曲病(Rice false smut)是在水稻穗部发生的重要病害,由稻曲菌(Ustilaginoidea virens)侵染引起。稻曲病不仅可造成水稻产量损失,且稻曲菌产生的毒素会污染谷物,对粮食安全造成严重威胁。本研究基于稻曲菌对水稻晚籼98的颖花侵染过程观察,使用RNA-seq技术对稻曲菌侵染各个阶段的样品进行深度测序,分析和鉴定稻曲菌侵染过程的差异表达基因和lncRNA,并对稻曲球发育相关基因UvCesA和稻曲菌生长相关lncRNA UvlncNAT-MFS进行了功能研究。此外,本研究还开发了一套基于比较基因组的稻曲菌特异性分子检测靶标筛选方法,并设计了6组稻曲菌巢式PCR检测引物。研究主要结果如下:(1)将稻曲菌从侵染至稻曲球形成的过程划分为5个阶段(Stage 1-5)。利用RNA-Seq技术对Stage 1、Stage 2、Stage 3和Stage 4这4个阶段的样品进行深度测序。以Stage 1作为对照,分析其余的3个阶段与第一阶段的差异基因,结果表明与稻曲菌侵染第一阶段相比,Stage 2、Stage 3和Stage 4分别鉴定到1031、1965和1972个显著上调表达的基因和1216、1666和1755个显著下调表达基因。q RT-PCR验证并分析稻曲菌MAPK、G蛋白亚基、果胶酶、角质酶以及纤维素酶等致病相关基因在4个侵染阶段的表达动态,结果与RNA-seq数据相吻合。将差异基因进行GO和KEGG富集,结果表明稻曲菌在侵染过程中大部分的差异表达基因都富集到糖类代谢和物质转运相关的功能通路,说明糖类物质的代谢与转化是稻曲菌侵染水稻颖花形成稻曲球的重要因子。同时,在稻曲菌侵染水稻颖花4个阶段的RNA-seq数据中,总共鉴定到1724条lncRNA,依据lncRNA在基因组上与基因的位置关系,将其分为linc RNA、lnc NAT、inc RNA和Sense transcript 4类,其中linc RNA 1084条、lnc NAT 566条、inc RNA 51条、Sense transcript 23条。对侵染过程中差异表达的linc RNA和lnc NAT预测的靶标基因进行GO富集分析,表明大部分差异表达的linc RNA和lnc NAT与稻曲菌的转运蛋白和物质转运相关。结合RNA-seq数据和q RTPCR针对筛选到的7条转运相关lnc NAT在侵染4个阶段的表达量进行分析,表明这7条lnc NAT与其对应的正义链基因在表达量上呈正相关关系。(2)对糖基转移酶2家族的纤维素合酶基因UvCesA的功能进行研究。UvCesA基因全长2567 bp,包含3个外显子和2个内含子,编码786 aa的蛋白,含有一个纤维素合成酶CESA_Cel A_like的结构域。在稻曲菌野生型菌株中对UvCesA基因进行敲除和互补,发现UvCesA基因参与调控稻曲菌菌落生长、产孢量以及对高渗透压、细胞膜压力、氧化压力的耐受性、对葡萄糖和乳糖的利用、菌丝细胞壁合成以及侵染能力和稻曲球的发育。UvCesA蛋白的亚细胞定位观察结果表明,UvCesA蛋白在稻曲菌中的定位会随着生长状态的变化而发生变化,主要定位于胞质和液泡中。(3)稻曲菌lncRNA UvlncNAT-MFS与其对应正义链上一个编码MFS蛋白的基因Uv MFS在3’端有452 bp的重叠区域,且UvlncNAT-MFS的原位杂交实验表明其分布于稻曲菌菌丝的细胞质中。对UvlncNAT-MFS与Uv MFS分别进行沉默和超表达以及对Uv MFS基因进行敲除和互补,结果表明UvlncNAT-MFS与Uv MFS的表达量呈现正相关,二者参与稻曲菌的生长速率、产孢以及对高渗透压、细胞膜压力和氧化压力的耐受性调控,但是并不影响稻曲菌的致病力。RNA酶保护试验验证了UvlncNAT-MFS和Uv MFS之间可以形成RNA-RNA二聚体,推测UvlncNAT-MFS通过与Uv MFS形成RNA-RNA二聚体的形式来对Uv MFS进行调控。该结果丰富了对丝状真菌中lncRNA调控机制的认识。(4)基于稻曲菌注释的基因组,采用比较基因组的方法,将稻曲菌注释的8231个蛋白序列与所构建的含有46个物种注释基因组的本地数据库和NCBI NR数据库进行两轮BLASTP比对筛选,获得96条稻曲菌特异性蛋白序列作为稻曲菌候选特异性检测靶标。随机挑选20个靶标,依据其DNA序列进行巢式PCR检测引物设计。用20组引物对采自全国11个省份的97株稻曲菌菌株的基因组DNA进行PCR扩增,其中19组引物可以稳定地在97株稻曲菌菌株中扩增到目标条带。特异性检测表明,19组引物均不能在除稻曲菌以外的其它与稻曲菌亲缘关系相近的真菌、田间常见病原菌以及不同品种水稻的基因组DNA中扩增出目标片段。灵敏度筛选结果表明,用19组引物对梯度稀释的稻曲菌DNA进行PCR扩增,其中有6组引物灵敏度较高,可以在浓度为10 fg/μl以下的稻曲菌DNA中检测到目的条带。用这6组引物对人工接种稻曲菌的水稻穗部以及田间采集的水稻根、茎、叶和穗的样本进行PCR检测,结果表明这6组引物都可以检测到植株中的稻曲菌,为田间稻曲菌的检测及稻曲病的预测预报提供技术支持。