论文部分内容阅读
杆状病毒是发现最早、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒。其中家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,简写BmNPV)是家蚕主要病害-血液型脓病的主要病原,每年给蚕桑业造成巨大的经济损失。由于对于BmNPV侵染增殖机制研究并不深入,迄今为止对于其感染家蚕导致的核型多角体病仍无有效控制的方法。虽然杆状病毒大多数基因的功能已经被阐明,然而仍有部分基因在病毒生活史中的作用未知,这严重制约了对该病毒感染分子机制的深入了解。本研究以BmNPV两个保守基因但功能仍然未知的基因,bm55a和bm109,作为研究对象,对其转录、表达以及亚细胞定位与病毒结构定位进行了系统研究,进一步利用Bac-to-Bac系统和Red同源重组系统,构建了基因缺失的重组病毒,阐明了它们在病毒生活史中所起的生物学功能。主要结论如下:1.BmNPV b58a基因的研究。bm58a基因位于BmNPV基因组nt 56,183-nt 56,310处,全长183 bp,编码60个氨基酸。RT-PCR分析表明,病毒感染后24h可检测到其转录产物,蛋白印迹结果显示病毒感染后24h可检测到Bm58a的表达。这些结果证明bm58a是极晚期基因。通过构建缺失型突变体发现,bm58a的缺失并不影响病毒的感染力,电镜分析显示病毒组装、多角体形成以及ODV包埋入多角体均未受到影响。生物学分析表明,bm58a并不影响病毒的经口感染,但昆虫死亡后的液化过程却受到严重干扰,说明Bm58a参与昆虫液化过程并发挥重要作用。2.BmNPV bm09基因的研究。bm109基因位于BmNPV基因组nt 103,571-nt 103,802处,全长663 bp,编码220个氨基酸。RT-PCR分析表明,病毒感染后12h可检测到其转录产物,蛋白印迹结果显示病毒感染后12 h可检测到Bm109的表达。这些结果证明bm109是晚期基因。通过构建基因敲除突变体发现,bm109的缺失显著降低了病毒的感染力。进一步分析显示,虽然Bm109是病毒衣壳蛋白,但病毒组装、多角体形成以及ODV包埋入多角体均未受到影响,但是核衣壳由病毒发生基质向核膜转运的过程却受到严重影响。在Bm109缺失的基础上,利用转座将不同的截短型的Bm109蛋白补回到Bm109缺失型病毒中,结果表明Bm109的C端对于该病毒的功能至关重要。进一步利用双向酵母双杂交系统对Bm109与杆状病毒其他结构蛋白之间的相互作用进行了研究,结果表明Bm109与FP和49K蛋白存在相互作用。