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研究背景及目的糖尿病肾脏病(DKD)系常见的糖尿病微血管并发症,也是导致终末期肾衰的主要原因之一。尽管多因素的综合干预减少了DKD的发生和发展,但是DKD的剩留风险仍然很高。更为可怕的是既往高血糖患者,即使后期血糖趋于达标,但DKD仍然持续进展,此称为“高糖记忆”,但其机制尚未完全阐明。近年来,足细胞作为肾小球滤过屏障的重要组成部分,发现高糖环境可引起足细胞损伤,且可向间质细胞转化(EMT),进而在DKD中的作用越来越受到重视。必须看到,对上述病理生理过程,既往的研究往往从已知的信号通路入手,难以避免主观性。为此,本文拟以小鼠足细胞为研究对象,体外模拟高糖记忆环境,采用高通量的转录组测序技术,探讨该模型下足细胞向间质细胞转化的新的靶分子。研究方法1.分组培养小鼠足细胞:正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×48h),高糖组(HG,30mmol/L D-葡萄糖×48h),记忆组(MG,30mmol/L D-葡萄糖×48h+5.5mmol/L D-葡萄糖×48h),渗透压组(OSM,5.5mmol/L D-葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇×48h)。免疫印迹及免疫荧光检测各组足细胞的EMT指标即蛋白nephrin和α-SMA的表达情况。2.Illumination HiSeq 2000进行NG、HG和MG的mRNA测序,并进行差异表达基因的基因本体(GO)和KEGG pathway富集分析。3.最后利用实时荧光定量PCR技术对所选的差异表达基因进行了初步验证。结果1.与正糖组相比,免疫印迹和免疫荧光均显示,高糖可诱导足细胞nephrin表达下调,α-SMA表达上调,即使后续正糖培养,上述异常仍持续存在。2.RNA测序(RNA-Seq)结果显示,高糖组和正糖组间存在194个基因差异表达,其中119个上调,75个下调。而记忆组与正糖组间则有532个基因差异表达,包含316个上调基因,216个下调基因。进一步比对上述差异基因,发现有108个基因(35个上调,73个下调)在高糖组和记忆组存在相似的表达规律。然后,对共有差异表达基因进行了数据挖掘分析:GO分析显示10条GO terms有显著性富集意义,KEGG pathway分析显示10条pathways有显著性富集意义。最后,分析发现Smad9,Id2,Snai1,Mapkapk3,Igf1,Fgf22,Lama1和Zfhx3这8个基因可能在足细胞EMT中发生了显著变化。3.实时荧光定量PCR验证了上述差异基因,结果发现除Id2验证结果无统计差异外,其余的靶基因均与测序结果相一致。结论1.高糖可诱导足细胞EMT,且存在“记忆现象”。2.在该模型中采用转录组测序发现几个新的靶分子,其中Smad9、Snai1和Mapkapk3表达上调,Igf1、Fgf22、Lama1和Zfhx3的表达下调,且其机制可能与TGF-β信号通路、黏着斑信号通路,Rap1信号通路和干细胞的多能调节等信号通路潜在相关。