研究背景黑色素瘤是皮肤癌最具侵袭性的恶性肿瘤,占皮肤肿瘤死亡率的80%。目前,黑色素瘤治疗的常用方法包括手术切除、化疗和放疗。然而,由于其耐药性和转移性,黑色素瘤患者的长期生存率并不理想,亟待寻求新的黑色素瘤治疗靶点和治疗策略。光动力疗法（PDT）因其对肿瘤组织的高选择性、对正常组织的毒副作用小及良好的美容效果,是目前继传统治疗方法之后的一种新的皮肤肿瘤的治疗手段。近年来,随着对PDT作用机制更深入的研究,认为PDT在诱导细胞凋亡方面效果显著,并且能够引发抗肿瘤免疫作用,可以预见,PDT将成为治疗黑色素瘤的一种全新疗法。尽管PDT抗肿瘤作用机制研究取得一定进展,但许多参与这一复杂过程的分子还未被发现,确切的作用机制还没有被完全阐明。因此,发现调控PDT抗肿瘤效应的新分子对于加深人们对PDT作用机制的认识和改进临床疗效具有重要的意义。蛋白4.1R最初是在人成熟红细胞中被发现的80KD细胞膜骨架蛋白分子,可以将跨膜蛋白与血影蛋白-肌动蛋白连接起来,对细胞正常形态结构的维持、细胞分裂、信号转导等功能发挥重要的作用。课题组前期研究,发现蛋白4.1R通过抑制CD8⁺T淋巴细胞膜受体LAT磷酸化及下游ERK信号通路而调控CD8⁺T淋巴细胞的活化、增殖和抗肿瘤活性;利用蛋白4.1R缺失的小鼠胚胎成纤维细胞MEF对PDT敏感性进行了研究,发现蛋白4.1R敲除降低PDT对细胞的杀伤效率。研究结果充分提示蛋白4.1R可能参与PDT抗肿瘤效应,成为一种新的分子治疗靶点,将有望推动黑色素瘤治疗的进展。研究目的本课题利用CRISPR/Cas9系统构建小鼠黑色素瘤B16-4.1R^-/-细胞模型,体外检测蛋白4.1R敲除对B16细胞PDT敏感性的影响及其可能的机制;构建C57BL/6J-B16皮下移植瘤模型,体内检测蛋白4.1R敲除对B16细胞PDT敏感性及其引起的抗肿瘤免疫效应的影响。从体内外水平探索蛋白4.1R对小鼠黑色素瘤细胞PDT效应的影响,为证实细胞膜骨架蛋白4.1R是一新发现的影响PDT疗效的调控分子提供实验依据。研究方法1.利用PCR和Western blot技术,从基因和蛋白水平鉴定B16细胞中蛋白4.1R的表达情况。2.利用CRISPR/Cas9系统构建敲除蛋白4.1R基因的B16细胞株。3.CCK-8法检测蛋白4.1R基因敲除对B16细胞增殖能力的影响;细胞划痕实验检测蛋白4.1R基因敲除对B16细胞迁移能力的影响;Transwell实验检测蛋白4.1R基因敲除对B16细胞侵袭能力的影响。4.CCK-8法检测B16-4.1R^+/+和B16-4.1R^-/-细胞经PDT处理后细胞的存活率;荧光分光光度法检测B16-4.1R^+/+和B16-4.1R^-/-细胞孵育5-ALA后,细胞内PpIX的积累量;荧光探针DCFH-DA法检测B16-4.1R^+/+和B16-4.1R^-/-细胞经PDT处理后活性氧的含量;FITC-Annexin V凋亡试剂盒检测PDT处理B16-4.1R^+/+和B16-4.1R^-/-细胞后两种细胞凋亡情况。5.荧光定量PCR法检测B16-4.1R^+/+和B16-4.1R^-/-细胞内5-ALA转运蛋白GAT-1、GAT-2 mRNA表达情况;Western blot法检测B16-4.1R^+/+和B16-4.1R^-/-细胞内GAT-1、GAT-2蛋白表达情况;免疫荧光法检测GAT-1、GAT-2在B16细胞中与蛋白4.1R的定位情况;免疫共沉淀法检测GAT-1、GAT-2在B16细胞中与蛋白4.1R的相互作用。6.将B16-4.1R^+/+和B16-4.1R^-/-细胞接种于C57BL/6J小鼠皮下,建立小鼠移植瘤模型,进行PDT处理,观察肿瘤体积变化;收集肿瘤组织,HE染色及CD8⁺T细胞免疫组化;荧光定量PCR法检测肿瘤组织中细胞因子（如IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α）mRNA的表达情况;收集血清,ELISA法检测细胞因子IL-12、IFN-γ的分泌情况。研究结果1.基因和蛋白水平均验证蛋白4.1R在小鼠黑色素瘤B16细胞中表达。2.利用CRISPR/Cas9系统成功构建敲除蛋白4.1R的B16细胞株,为后续实验奠定了基础。3.B16-4.1R^-/-细胞的增殖、迁移、侵袭能力均显著高于B16-4.1R^+/+细胞。4.5-ALA-PDT处理两种基因型细胞,CCK-8检测细胞存活率发现:B16-4.1R^-/-细胞的存活率显著高于B16-4.1R^+/+细胞;荧光分光光度计检测细胞内PpIX积累量发现:B16-4.1R^+/+细胞内PpIX积累量显著高于B16-4.1R^-/-细胞;DCFH-DA法检测PDT处理后细胞内ROS含量发现:B16-4.1R^+/+细胞内ROS的含量显著高于B16-4.1R^-/-细胞;FITC-Annexin V凋亡试剂盒检测PDT处理后两种细胞凋亡情况发现:B16-4.1R^+/+细胞的凋亡率显著高于B16-4.1R^-/-细胞。5.B16-4.1R^+/+细胞内5-ALA转运蛋白GAT-1、GAT-2的mRNA及蛋白表达量均显著高于B16-4.1R^-/-细胞;免疫荧光结果显示:在B16细胞中,GAT-1、GAT-2与蛋白4.1R共定位;免疫共沉淀结果显示:在B16细胞中,GAT-1、GAT-2与蛋白4.1R存在相互作用。6.皮下瘤移植模型实验结果显示:与WT组相比,WT-PDT组肿瘤体积明显减小,细胞因子（IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α）mRNA表达量均显著升高,IL-12、IFN-γ的分泌量也显著升高;与KO组相比,KO-PDT组肿瘤体积也有变小,但效果不如WT-PDT组,细胞因子的表达量和IL-12、IFN-γ的分泌情况无统计学差异;与KO-PDT组相比,WT-PDT组肿瘤体积显著小于KO-PDT组,细胞因子（IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α）的mRNA表达量高于KO-PDT组,IL-12、IFN-γ的分泌量高于KO-PDT组;HE染色结果显示:WT组与KO组,细胞呈正常状态,KO-PDT组肿瘤组织细胞核出现明显的核固缩,WT-PDT组肿瘤组织损伤最为严重,出现大面积凋亡或坏死;CD8⁺T细胞免疫组化结果显示:WT-PDT组CD8⁺T细胞浸润的数量高于KO-PDT组。研究结论1.蛋白4.1R基因敲除促进B16细胞的增殖、迁移和侵袭能力。2.在B16细胞中,蛋白4.1R与GAT-1和GAT-2相互作用,蛋白4.1R敲除引起GAT-1和GAT-2的表达量下降,进而影响5-ALA的跨膜转运,导致细胞内PpIX的积累量、ROS的含量、细胞凋亡等一系列反应发生变化,从而降低PDT对细胞的杀伤效果。3.体内实验验证蛋白4.1R基因敲除降低PDT的杀伤效果,且蛋白4.1R基因敲除下调PDT引发的抗肿瘤免疫应答。