丁二酮是一种常见的C4平台化合物,在食品、化工等领域有着广泛的应用。传统上生产丁二酮的方法包括天然产物提取法及化学合成法等,但二者均存在成本较高、污染严重等缺点。近年来微生物发酵法生产丁二酮受到越来越多的关注。本课题以产丁二酮的芽孢杆菌Bacillus sp.DL01-ΔalsD作为出发菌株,对该菌株进行代谢途径改造以及发酵条件优化,最大限度地提高该菌株中丁二酮的产量,为工业上利用微生物发酵法生产丁二酮提供理论依据。以B.sp.DL01-ΔalsD为出发菌株,构建温敏型质粒pKS1-pta,利用无痕敲除技术将菌株乙酸代谢途径上的关键酶磷酸转乙酰基酶（PTA）的编码基因pta敲除,获得菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta。摇瓶发酵实验结果表明,敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的乙酸产量明显下降,丁二酮的产量显著提高,达到3.67 g/L,是出发菌株B.sp.DL01-ΔalsD（2.82 g/L）的1.3倍。克隆来自于B.subtilis 168的乙酰乳酸合成酶基因,构建过表达质粒,转化B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta,获得重组B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta-alsS₁₆₈菌株,摇瓶发酵丁二酮产量达到5.43 g/L,是敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的1.48倍。基于发酵罐水平的发酵温度、通风量以及搅拌转速三个发酵条件单因素实验,利用MATLAB软件构建Back Propagation（BP）神经网络模型,通过遗传算法对神经网络极值寻优,预测出菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta-alsS₁₆₈发酵产丁二酮最优条件为35.7℃,0.66 vvm以及179 r/min。在此条件下进行补料发酵,控制葡萄糖浓度为10 g/L,发酵时间为60 h,丁二酮产量达11.18 g/L,产率为0.16 g/g葡萄糖,是目前文献报道的最高值。综上,本论文研究通过阻断乙酸生成途径,过表达乙酰乳酸合成酶并对菌株发酵条件进行拟合优化,大幅提高了菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta-alsS₁₆₈的丁二酮产量,对食品安全菌发酵生产丁二酮具有理论意义和应用价值。