论文部分内容阅读
前言内毒素（endotoxin）为革兰氏阴性菌（Gram’s negative,G-）细胞壁的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）组分,是引起脓毒血症（sepsis）和感染性休克（septic shock）的关键因素。内毒素激活多种细胞因子,产生级联放大效应,损伤血管内皮细胞,最终导致多器官功能衰竭（multiple organ failure,MOF）。目前,大多数学者认为脓毒血症并发多器官功能衰竭可能与血管内皮细胞凋亡、宿主过度反应性及免疫网络失控等因素有关,其中血管内皮细胞凋亡在脓毒血症的发生、发展中起重要作用,但是确切的机理尚不清楚。研究表明,血管内皮细胞覆盖整个循环系统内表面,不仅起屏障作用,还有调节细胞代谢产物、调节血管舒张、止血和趋化白细胞的作用。血管内皮细胞生长、凋亡和生存的协调状态,是保证正常血管功能和结构的重要基础,是维持血管稳态的决定性因素。血管内皮细胞是一种代谢活跃的细胞,体内外多种刺激因子均可作用于内皮细胞,从而诱发凋亡。血管内皮细胞发生凋亡,会影响血管内皮细胞的再生,导致血管壁结构的破坏,还会影响血管内皮依赖性舒张功能,甚至还可影响到血管周围的组织细胞,因此深入了解血管内皮细胞凋亡发生发展的规律,对寻找保护内皮的措施有重要意义。在感染性休克、多器官功能障碍综合征时,如何及时保护血管内皮细胞,维持内皮细胞功能正常,将对保护心脏、肺、脑、肝脏等重要脏器功能有积极的作用。因此,本课题设计对体外培养的人脐静脉内皮细胞施以不同浓度脂多糖处理后,检测在各时间点的细胞凋亡率,分析不同浓度脂多糖诱导内皮细胞凋亡的差异,为深入研究脓毒血症的发病机理和抗细胞凋亡治疗提供理论基础。实验材料与方法一、实验材料1、实验细胞人脐静脉内皮细胞ECV304细胞株2、主要试剂及药品DMEM/F-12培养基、脂多糖、0.25%胰蛋白酶、10%胎牛血清、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、四甲基偶氮唑盐、二甲基亚砜。3、主要仪器超净工作台、细胞培养箱、低温离心机、细胞培养瓶、细胞培养板、超低温冰箱、倒置相差显微镜、全自动酶标仪、微孔滤器、流式细胞仪。二、实验方法1、细胞培养细胞复苏后,培养72小时,加入2m10.25%胰蛋白酶消化,2～3分钟后吸出消化液弃掉,再加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基,轻轻吹打混匀细胞,按1:2传代于细胞培养瓶中。于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养,每2～3天换液一次,3～4天传代一次,待细胞生长至一定数量后,取培养24h的细胞用于实验。2、实验分组根据MTT实验结果,将细胞分为4组:空白对照组、1组（脂多糖浓度为6.25ug/ml）、2组（脂多糖浓度12.5ug/ml）、3组（脂多糖浓度25ug/ml）及4组（脂多糖浓度50ug/ml）。每组3个标本,分别于4h、12h、24h及48h收集细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡。3、Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作,在流式细胞仪上每个标本计数1×104个细胞。4、数据统计采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理,运用重复测量资料的方差分析。实验数据以均值±标准差表示,组间比较用多个样本均数两两比较的SNK法,P＜0.05有显著性差异。实验结果一、脂多糖对血管内皮细胞的形态学影响在倒置相差显微镜下观察正常对照组培养24h的人脐静脉内皮细胞,大部分细胞贴壁,细胞呈梭性或不规则三角形,核清晰,有些细胞鱼贯状相连;而脂多糖处理组细胞形态有明显受损的改变,胞体变圆、边缘不清、受损细胞发生皱缩,近似细胞凋亡表现。二、MTT实验测定细胞生长抑制率人脐静脉内皮细胞被脂多糖干预后,细胞生长受到抑制,脂多糖的浓度与细胞生长抑制率成正比,从脂多糖浓度为3.125ug/ml时的20.16%,到脂多糖浓度200ug/ml时的91.68%。其中,细胞生长抑制率变化明显、并且吸光度值有显著差异的脂多糖浓度为6.25ug/ml～50ug/ml（P＜0.05）,因此接下来的实验选择6.25ug/ml、12.5ug/ml、25ug/ml及50ug/ml脂多糖浓度分组。三、流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡不同浓度脂多糖组在4h、12h、24h及48h的细胞凋亡率与对照组比较都有显著差异（P＜0.05）,即脂多糖能够诱导内皮细胞凋亡;而各脂多糖浓度组之间比较,除在4h时无显著差异（P＞0.05）外,在12h、24h及48h都有显著差异,即在12h、24h及48h 3个时间点脂多糖浓度增大,内皮细胞凋亡率随之增加;同一浓度脂多糖组在4h、12h及24h时的细胞凋亡率有显著差异（P＜0.05）,但是与48h比较无统计学意义,即在4h～24h之间,一定浓度的脂多糖作用于内皮细胞,随时间延长,细胞凋亡率增加。结论1、脂多糖能够在体外抑制人脐静脉内皮细胞生长。2、脂多糖体外抑制人脐静脉内皮细胞生长有浓度依赖性。3、脂多糖体外诱导人脐静脉内皮细胞凋亡在一定范围内具有剂量和时间依赖性。