目的 拉米夫定作为慢性乙型肝炎的首选抗病毒药物，近年来被广泛应用。但持续用药1年后约24％的病人出现耐药；若治疗时间超过4年，该比例将上升至70％。目前国内外研究中关于拉米夫定耐药相关基因变异最常见的是HBV聚合酶C区的YMDD基序。本课题从HBV准种的角度出发探讨药物耐受问题，以HBV聚合酶基因为研究靶区域，PCR扩增拉米夫定治疗前后病人血清标本中HBV DNA部分序列，TA克隆后采用单链构象多态性／异源双链分析(SSCP／HDA)筛选优势准种并测序，初步了解拉米夫定治疗前后HBV准种的分布情况和HBV聚合酶基因包括YMDD在内的序列的变异情况。 方法 (1)标本的前筛选中使用熔解温度曲线法初步分析YMDD突变型。(2)选择6例病人拉米夫定治疗前后12份血清标本，PCR扩增HBV聚合酶基因部分序列；PCR产物纯化后与载体(pCR2.1)连接，转化感受态细菌(INVαF’)；每份标本中获取33个阳性克隆，再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳完成单链构象多态性／异源双链分析，最后测定电泳条带的移行距离，得出准种数和准种分布，计算准种复杂性和优势克隆比例。(3)每份标本选择一个优势准种测序，在Genebank中分别进行核苷酸和氨基酸比对，找出同义突变和非同义突变，计算突变率。(4)在单链构象多态性／异源双链分析同时选择1例病人进行限制性片段长度多态性分析，对每一个克隆的YMDD变异情况作出准确了解。(5)将YMDD变异的出现与病人临床指征相结合进行分析，得到病人治疗过程中变异出现前后ALT和HBV DNA随时间的变化趋势。 结桌 (1)熔解温度曲线分析法所得38例病人LAM治疗前后YMDD的变异结果经后续实验证实与事实相差较大，只能作为标本选择时的参考指标之一。(2)12份标本逐一分析，其中病人D最为典型。治疗前后的准种组成变化最大，准种复杂性改变最大。治疗前标本的图谱中可见上方的单链DNA和下方的同源、异源双链DNA的条带模式均有较大差异，经测定，确定准种数14，组成为11，5，4，3，1，1，1，1，1，1，1，1，1，1。而治疗后标本条带模式非常一致，准种数降至6，第三军医大学硕士学位论文组成为28，1，1，1，1，1。提示准种数目从多到少变化。综合分析6例病人标本，治疗前准种数在7一14(平均9.8)，均高于治疗后准种数4一8(平均5.7)，t=3.98，p<0.05。6例病人治疗前优势准种比例在33.3%一81.8%;治疗后显著升高 (78.8%一90.9%)，t=3.24，尸<0.05。(3)选择优势克隆测序，6例病人经拉米夫定治疗后2例出现M550V几526M，3例M5501变异，l例无YMDD变异。病人A~F的碱基突变率分别为6.5、6.5、4.3、10.9、13.0、8.7bp/Ikb。(4)限制性片段长度多态性分析结果表明病人D治疗前33个克隆中32个为YMDD，治疗后33个中有29个克隆是YIDD，余下的为其它同义突变。(5)结合临床资料分析，YMDD变异出现后，HBV DNA均回复到治疗前水平，ALT则不完全相同，4例上升>2 x ULN，1例仍在正常范围。 结论(l)拉米夫定治疗导致6例病人中2例YMDD基序发生YVDD变异、3例YIDD变异。1例病人未出现一个非同义突变，且实验室和临床各项指标均无显著改变，提示拉米夫定耐药可能还存在其它原因，如天然耐药现象。(2)拉米夫定对HBV聚合酶基因存在选择压力，使治疗后HBV准种数减少，准种复杂性降低，优势准种比例升高。(3) YMDD变异出现后，所有病人的HBVDNA增高，部分病人的ALT增高。