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离子束介导玉米DNA片段转化水稻经5年的培育筛选,已经获得了一批基本稳定遗传的变异株系。本文选用变异群中6个变异株系作为研究对象。首先分析了各变异株系的农艺形状,各变异株系与水稻对照在表型上有较大差异,变异株系的表型差异主要表现为:株型高大,茎杆粗壮,叶鞘为紫色,颖尖显现红紫色,高度不育、特早熟、特多分蘖、特矮化株系以及穗型和剑叶直立程度等,有的变异株系具有上述的一种表型变异特征,而有的具有多种表型变异特征。
用SDS-PAGE电泳技术,在蛋白质水平对上述6种变异株系进行差异分析,检测比较了苗期、孕穗期和抽穗期各变异株系和对照间蛋白差异表达,结果发现各变异株系和对照间有较大的差异,各变异株系中的蛋白带有的增多,如苗期中在变异株系A、B、C、D和E中均检测到新增的41kD蛋白,在抽穗期变异株系A、D检测到新增带38kD。有的蛋白带减少,如在孕穗期变异株系C、D和F的均少检测到一条23kD蛋白带,在抽穗期变异株系A、B和F均少检测到56kD蛋白带。又用复性电泳技术分析比较了各变异株系和对照在几个主要生育期的蛋白水解酶和POD的差异表达情况,检测pH4.5、pH7.0和pH8.5时各时期蛋白水解酶酶谱变化,发现变异株系和对照在各时期不同pH条件下酶种类和酶活性均差异显著,在变异株系中检测到玉米中的几条“目的酶带”,如在孕穗期pH4.5条件下,变异株系A、B、D中均检到44kD和56kD强带,而对照CK2中未检到,在抽穗期pH7.0条件下玉米对照CK1中检到44kD强酶带区,在变异株系A、B、D中也检到,水稻对照CK2中未检测到。等变异株系中还检测到对照中未检到的一些新酶带,如变异株系B在孕穗,抽穗期检测到一条210kD酶带。在水稻苗期、三叶期、分蘖期、孕穗期、抽穗期叶片中的POD检测结果表现为:变异株系和对照水稻间的POD酶谱差异较大,有POD酶带的缺失和新增,如苗期变异株系A中少检测到34kD酶带,变异株系D中少检测到30kD酶带,三叶期变异株系A和D多检测到21和65kD酶带,变异株系B多检测到34和38kD酶带。还有酶活增强和减弱的变化,如苗期变异株系A中的24和30kD酶活比对照CK2增强,21kD酶活比对照减弱,三叶期变异株系B中的25kD酶活比对照增强。并且也检测到了玉米中的几条“目的酶带”,如分蘖期在变异株系A、B、C、D和F中检测到的26kD弱带在玉米对照CK1中检测到在水稻对照CK2中未检测到。这些在蛋白水平上检测到的差异条带说明经低能离子束介导转基因处理的变异株系可能使其基因组发生了某些改变。而这些新增或缺失的酶带可能跟相关的变异性状有紧密的联系,对该类酶带的深入研究可能对揭示相关的变异性状分子机理有一定的理论价值。
用AFLP分子标记技术对变异材料进行多态分析,首先筛选了64对选扩引物,并统计分析64对选扩引物在4个样品材料中的扩增情况,优选出下列18对引物对:P1M3、P2M3、P2M5、P2M7、P2M8、P3M7、P4M3、P4M4、P5M3、P6M1、P6M2、P6M5、P6M7、P8M2、P8M3、P8M5、P8M6和P8M8。统计发现对照水稻和玉米虽属于不同的属,但二者的图谱仍有28.86%相似率,而2个变异株系和玉米的图谱相似率分别达到36.13%和32.57%,变异株系和玉米间的相似性增加,原因可能是外源的玉米DNA整合到水稻核基因组引起的,但有待进一步研究证实。另外发现变异株系和对照在DNA水平上存在较大的差异,说明了水稻经低能离子束介导转基因处理后其基因组内部发生了改变,但其发生的机理较复杂,仍不清楚。
用优选出的引物对6个特殊的变异材料进行AFLP分析,克隆、测序并分析了“目的片段”,对目的片段序列做相似性分析发现目的片段间的相似性较低,在对差异片段序列的生物信息学分析发现这些片段大多数能在数据库中搜索到100%匹配率的序列,匹配的序列有的信息较清楚,但相关的基因功能不清,有些匹配的序列存在某些碱基位点的差异,存在单核苷酸多态性。
对特早熟变异株系AFLP和差异片段序列分析,克隆测序的几个差异片段在数据库中均未检测到完全匹配的序列。部分序列仅检测到覆盖率70%,匹配相似率100%,匹配区位于3’端或5’端的水稻序列,且相应另一端有覆盖率30%,相似率90%的玉米序列。根据生物信息学分析,猜测这类序列可能是外源的玉米DNA片段插入到水稻基因引起,猜测还需后续相关实验验证。部分匹配较高的序列功能未知,所以要确定差异片段是否变异性状存在某些关联有待进一步的研究来证实。