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研究目的:利用棕榈酸(palmitate acids)处理体外分化成熟肌管,构建饱和脂肪酸诱导肌肉内质网应激反应模型,研究饱和脂肪酸作用于骨骼肌的早期阶段AMPK通路激活与内质网应激的相关性研究,以及不同程度激活AMPK通路对于内质网应激的影响,从而为预防肥胖诱导的病理变化提供理论指导。研究方法:(1)以体外诱导分化成熟的肌管为研究对象,利用饱和脂肪酸中主要成分palmitate处理肌管不同时间(3h、6h、12h、24h),提取总蛋白和RNA;利用Western blotting检测p-AMPK和内质网应激PERK通路下游蛋白在palmitate处理肌管不同时间点后的动态变化。(2)选取AMPK通路激活程度与内质网应激最为相关的时间点,利用Compound C抑制AMPK信号通路的激活,利用Real-time PCR和Western blotting检测AMPK阻断后对于palmitate诱导的内质网应激PERK通路下游基因与蛋白表达的影响。(3)利用不同浓度AICAR处理肌管,利用Western blotting和Real-time PCR检测不同程度激活AMPK对内质网应激PERK通路下游基因与蛋白表达的影响,明确单纯激活AMPK通路对于内质网应激的剂量依赖性;选取对内质网应激激活程度最为显著的AICAR浓度,处理细胞不同时间点,利用Real-time PCR和Western blotting检测不同时间点激活AMPK通路对于内质网应激PERK通路下游基因与蛋白表达的影响,明确单纯激活AMPK通路对于内质网应激的时间依赖性。研究结果:(1)在palmitate处理细胞3h、6h、12h、24h后,检测到p-AMPK蛋白在12h激活程度最显著(P<0.001),且内质网应激PERK通路下游蛋白p-eIF2ɑ、ATF4、CHOP也在12h表达最显著(P<0.01)。(2)利用AMPK抑制剂Compound C与palmitate共同处理肌管12h,阻断AMPK通路后,显著降低了palmitate诱导的p-AMPK蛋白的激活(P<0.05),同时内质网应激PERK通路下游蛋白p-eIF2ɑ、ATF4、CHOP表达显著下降(P<0.05);抑制AMPK通路后内质网分子伴侣BiP mRNA和内质网应激PERK通路下游基因ATF4、CHOP、GADD34mRNA表达显著下降(P<0.001)。(3)利用0.125-2mM AICAR处理肌管,当AICAR浓度为1-2 mM时,p-AMPK蛋白激活程度最为显著(P<0.001),当AICAR浓度为0.5-1mM时,内质网应激PERK通路下游蛋白ATF4表达显著升高(P<0.01),同时检测到内质网分子伴侣BiP mRNA和PERK通路下游基因ATF4、CHOP、GADD34mRNA显著升高(P<0.05);选取AICAR浓度1mM处理不同时间点肌管3h、6h、12h,当处理时间为12h时,p-AMPK蛋白激活程度最显著(P<0.001),内质网应激PERK通路下游蛋白ATF4在3-6h显著升高(P<0.001),同时检测到内质网应激分子伴侣BiP mRNA和PERK通路下游基因ATF4、GADD34mRNA显著升高(P<0.05)。研究结论:在饱和脂肪酸处理细胞不同时期,AMPK信号通路在12h内激活,并且与内质网应激相关,而24h后p-AMPK表达受到显著抑制;利用特异性抑制剂Compound C阻断AMPK通路,可以显著缓解饱和脂肪酸诱导的内质网应激反应,即AMPK通路的激活对于饱和脂肪酸诱导的早期内质网应激是必需的;AICAR对于内质网应激的作用存在显著的时间依赖性和剂量依赖性,即在较低浓度状态下(0.5-1mM)AICAR能明显激活骨骼肌内质网应激,即适度激活AMPK信号通路足以激活内质网应激。