【摘 要】
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背景:结肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,它也是导致肿瘤相关死亡第三大常见原因。虽然肿瘤筛查技术不断进步,但由于结肠癌早期不易被发现,且其容易侵袭、转移和复发,导致患者术后五年生存率仍处于低水平。近年来的研究表明肿瘤干细胞(CSCs)可能参与了结肠癌的转移和复发。肿瘤微环境中存在着一种多效性的调节因子-白血病抑制因子(LIF),通过调节不同的信号通路参与多种实体肿瘤的增殖、侵袭、转移及放化疗敏感
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背景:结肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,它也是导致肿瘤相关死亡第三大常见原因。虽然肿瘤筛查技术不断进步,但由于结肠癌早期不易被发现,且其容易侵袭、转移和复发,导致患者术后五年生存率仍处于低水平。近年来的研究表明肿瘤干细胞(CSCs)可能参与了结肠癌的转移和复发。肿瘤微环境中存在着一种多效性的调节因子-白血病抑制因子(LIF),通过调节不同的信号通路参与多种实体肿瘤的增殖、侵袭、转移及放化疗敏感性。但LIF调控结肠癌CSCs的具体机制尚不明确,因此深入探讨LIF在结肠癌CSCs中发挥作用的分子机制,将为结肠癌CSCs的临床治疗提供一个新的作用靶点。目的:初步探讨LIF增强结肠癌细胞干性的分子机制。方法:1.利用TCGA公共数据库和RNAscope原位杂交方法分析LIF在结肠癌组织中的表达情况;2.应用RT-PCR和Western blot检测9种常见结肠癌细胞系中LIF和LIFR的表达水平;3.LIF蛋白纯化以及应用慢病毒感染系统构建稳定敲低LIF的细胞系,RT-PCR和Western blot检测细胞系建立情况;4.应用干细胞成球实验检测外源性LIF对结肠癌细胞成球能力的影响;5.应用RTCA、平板克隆实验及迁移实验检测敲低LIF后,结肠癌细胞增殖和迁移能力的变化;6.应用RT-PCR和wes检测外源性LIF对结肠癌肿瘤球细胞干性相关标志物CD44表达的影响;7.应用RT-PCR和Western blot检测敲低LIF,结肠癌细胞干性相关标志物CD44及CD44剪接变异体的表达变化;8.应用RT-PCR和Western blot检测外源性LIF处理后的肿瘤球细胞和敲低LIF的结肠癌细胞中转录因子ELF3和CD44表达变化。结果:TCGA公共数据库分析显示与癌旁组织相比,结肠癌组织中LIF的表达水平更高,且LIF高表达的结肠癌患者无病生存期较短,RNAscope原位杂交结果显示LIF在结肠癌组织中阳性细胞率和染色程度更高。RT-PCR和Western blot结果显示两种结肠癌细胞中LIF m RNA水平及蛋白表达水平降低,表明敲低LIF的稳定细胞系构建成功。干细胞成球实验显示外源性LIF可增强结肠癌细胞的成球能力。RTCA和迁移实验结果显示敲低LIF可抑制结肠癌细胞的增殖和迁移,这也进一步证实了LIF能增强结肠癌细胞的干性表型。RT-PCR和wes结果显示外源性LIF可上调结肠癌肿瘤球细胞CD44的表达,而敲低LIF可抑制结肠癌细胞干性相关标志物CD44的表达。此外,本研究发现敲低LIF后,结肠癌细胞CD44剪接变异体的转录水平降低。为进一步阐明LIF增强结肠癌细胞CD44表达的分子机制,我们通过外源性添加LIF和敲低LIF两方面证明LIF可特异性增强转录因子ELF3的表达水平,而敲低LIF可同时降低ELF3和CD44的表达水平,表明LIF可能通过调节ELF3的表达,进而增强癌细胞CD44分子的表达。结论:1.LIF在结肠癌组织中高表达,且其高表达的患者无病生存期较短;2.LIF增强结肠癌细胞干性相关标志物CD44的表达;3.LIF通过上调转录因子ELF3,进而增强结肠癌细胞CD44的表达。
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