论文部分内容阅读
支气管哮喘是是呼吸系统的常见病和多发病,临床上一般分为速发型哮喘反应(immediate asthmatic response, IAR)和迟发型哮喘反应(late asthmatic response, LAR)两大类。病理研究发现在 IAR 急性发作时,气道黏膜上皮杯状细胞明显增生,黏液合成和分泌过多,形成黏液栓,从而导致气道严重阻塞并引起呼吸衰竭,这是哮喘急性发作的主要死因之一。文献报道,白介素(interleukin,IL)-4、肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor,TNF)-α等炎性介质可上调气道上皮细胞黏蛋白基因的表达,促进黏蛋白合成和分泌增加。黏液栓的形成和过度通气造成气道表面张力和表面液体渗透压升高,使气道反应性增高。水通道蛋白(Aquaporin,AQP)是一组与水分子通透有关的特异性细胞膜转运蛋白。其中,AQP5 在哺乳动物气管、主支气管直至细支气管的纤毛柱状上皮细胞顶膜、黏膜下腺腺泡细胞顶膜及 I 型肺泡上皮细胞均有丰富的表达。研究发现,AQP5 基因敲除小鼠气道反应性增高,小鼠肺部感染病毒后 AQP5mRNA 和蛋白表达水平明显下降, TNF-α则下调小鼠肺泡上皮细胞 AQP5mRNA 和蛋白的表达。哮喘发作时杯状细胞增生,气道内黏液增多且粘稠不易排出以及黏液栓的形成,提示可能存在气道上皮水分转运下降。迄今为止,国内外尚未见有关哮喘中 AQP 表达情况的报道。本研究以人原代支气管上皮细胞和 BALB/c 哮喘小鼠为研究对象,采用了细胞培养、免疫组织化学和分子生物学等方法,首次检测了 AQP5 在哮喘小鼠气道及肺组织中的变化,并原代培养出人支气管上皮细胞,应用炎性介质及糖皮质激素对细胞进行干预,初步探讨 AQP5 变化的可能机制,结果发现哮喘小鼠气道及肺组织中AQP5mRNA 及蛋白表达水平下降;IL-4 和 TNF-α下调支气管上皮细胞 AQP5 蛋白的表达,地塞米松则上调 AQP5 的表达。结果提示 AQP5 可能参与并介导了炎性介质影响哮喘的发生和激素治疗哮喘的机制,这为深入研究哮喘的发生机制,并进一步探讨糖皮质激素的作用机制,开辟了新的研究领域。具体工作分以下三部分: 第一部分 AQP5 在人支气管上皮细胞和 BALB/c 小鼠呼吸道中的表达 目的:建立经纤维支气管镜刷检和植块法培养人原代支气管上皮细胞(human - 2 -<WP=6>bronchial epithelium cells,hBECs)的方法并观察原代支气管上皮细胞增殖分化特点。观察 AQP5 在人支气管上皮细胞和 BALB/c 小鼠呼吸道的表达分布。方法:采用无血清支气管上皮细胞培养基,对经纤维支气管镜刷检获得的人支气管上皮细胞和手术获得的人支气管标本进行原代培养并传代,分别通过倒置相差显微镜、台盼蓝染色、HE染色、阿尔辛蓝-雪夫碘(Alcian Blue -Periodic Acid Schiff,AB-PAS)染色、染色体分析和细胞角蛋白免疫组化等方法观察培养并鉴定细胞的生长特性和活性。应用免疫组织化学染色法观察 hBECs 及小鼠肺组织切片 AQP5 的表达分布。结果:①经纤维支气管镜刷检,每例可获得支气管上皮细胞 1～2×106,台盼蓝拒染法显示细胞成活率在 60%以上,获得的细胞为单一的气道上皮细胞,无成纤维细胞混杂,细胞可传代 7～8 代。长约2cm的叶支气管经过植块后共可获得支气管上皮细胞1.5×107,细胞成活率在90%以上。根据生长曲线,计算出人支气管上皮细胞的群体倍增时间为 49.6h。细胞群体倍增时间与开始接种密度明显相关。细胞形态不规则、呈鹅卵石样分布。细胞角蛋白表达阳性。部分细胞内见黏蛋白颗粒,考虑为杯状细胞,占细胞总数的 20.82%±13%。所培养的第 1～4 代细胞 23 对(46 条)染色体正常。②免疫组织化学染色结果显示,hBECs 细胞膜及细胞浆有 AQP5 免疫阳性物质表达,小鼠气管、支气管直至细支气管柱状上皮细胞胞浆及顶膜,以及肺泡上皮细胞胞浆及胞膜可见 AQP5 免疫阳性物质表达。肺内细支气管的上皮细胞未见表达。结论:本实验建立了经纤支镜直视下刷检和植块法分别原代培养支气管上皮细胞的方法,无血清培养基可提供较为满意的生长条件,为下一步研究或研究不同疾病中气道黏膜的功能提供了良好的实验模型。人支气管上皮细胞及小鼠呼吸道表达 AQP5 为以下实验奠定了基础。 第二部分 BALB/c 急性哮喘小鼠呼吸道 AQP5 表达的变化 目的:观察 AQP5mRNA 和蛋白在 BALB/c 急性哮喘小鼠呼吸道表达的变化。方法:40 只健康雌性 BALB/c 小鼠随机等分为正常对照组和哮喘组。应用卵蛋白(Ovalbumin,OVA)腹腔致敏和鼻腔滴注的方法制备小鼠哮喘急性发作的动物模型。通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察哮喘小鼠气道及肺组织病理改变,采用免疫组织化学方法、western blot 法和实时 PCR(polymerase chain reaction)法,检测并比较正常对照组与哮喘组小鼠气道及肺组织 AQP5mRNA 和蛋白表达的差异。结果:①哮喘组小鼠在 OVA 滴鼻激发时出现烦躁不安、呼吸急促、腹肌痉挛、喘鸣等表现。末次激发后 24 小时,HE 染色可见支气管及其伴行血管周围大量炎性细胞浸润,以嗜酸细胞、淋巴细胞和中性粒细胞为主,肺间质可见淋巴细胞和嗜酸细胞轻度浸润。支气管管壁 - 3 -<WP=7