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第一部分Sortilin促进胶质母细胞瘤细胞侵袭的机制研究目的高侵袭性是胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)的典型生物学特征,且预示GBM患者的不良预后。据报道,分拣蛋白(Sortilin)在高级别胶质瘤中表达上调,但Sortilin在GBM进展中的潜在作用未有研究。本章旨在探讨Sortilin在GBM细胞中的促侵袭作用及相关机制。方法利用TCGA数据库分析Sortilin的表达水平在临床GBM患者预后中的预测价值;利用划痕实验、小室穿透实验、裸鼠移植瘤实验等检测Sortilin对于GBM细胞的体内外侵袭能力的影响;利用免疫组化、蛋白免疫印迹、免疫荧光及聚合酶链反应等方法检测相关蛋白及m RNA的表达。结果1.与正常脑组织相比,Sortilin蛋白表达在GBM中明显上调。在GBM的四种分子亚型中,间质型GBM的Sortilin表达水平最高。同时,Sortilin蛋白的表达水平与GBM患者的临床预后呈明显的负相关。2.利用si RNA下调Sortilin表达或者抑制剂AF38469(一种口服生物活性的sortilin抑制剂)阻断Sortilin功能均能够通过逆转GBM细胞的间质转化而抑制细胞的水平迁移和空间侵袭能力。3.Sortilin通过激活GSK-3β/β-catenin/Twist信号轴促进GBM细胞的间质转化和侵袭。4.Sortilin的阻滞剂-AF38469能够明显抑制裸鼠皮下和颅内GBM移植瘤的侵袭性生长,并延长原位荷瘤小鼠的生存时间。结论本研究证实了Sortilin在GBM的侵袭和间质转化中的关键作用,表明sortilin对GBM的进展具有促进作用,Sortilin能够成为抑制GBM侵袭而改善患者预后的潜在靶点,其阻滞剂AF38469可能成为治疗高表达Sortilin的GBM患者的潜在药物。第二部分Sortilin促进胶质母细胞瘤细胞增殖的机制研究目的细胞内化过程在多种肿瘤的发生和进展中发挥着重要的作用。据报道,Sortilin调节细胞内外多种蛋白的细胞内化及转运过程;同时Sortilin也促进了多种肿瘤细胞的增殖。但是Sortilin在GBM细胞增殖中的作用仍不清楚。因此,本研究旨在阐明Sortilin在调控GBM细胞增殖中的作用与相应的机制。方法利用CCK-8实验、ed U染色、流式细胞仪分析等实验检测GBM细胞的增殖情况;利用免疫组化、免疫蛋白印迹检测相关蛋白的表达;利用抑制剂处理、小干扰RNA和慢病毒转染以调节Sortilin和卷曲蛋白受体-6(Frizzled-6,Fzd6)的功能以及检测Sortilin对Fzd6的细胞内转运的影响;利用邻位连接技术、细胞多重免疫荧光染色和共聚焦显微镜实验检测Fzd6在细胞膜、早期内含体、晚期溶酶体和回收内含体中的分布变化;利用裸鼠皮下移植瘤和颅内原位移植瘤模型检测Sortilin和Fzd6体内GBM中的作用。结果1.Sortilin通过加速细胞周期的G1/S期进展而促进GBM细胞的增殖。2.Fzd6在高级别胶质瘤组织中的表达较低级别胶质瘤和正常脑组织明显升高。Fzd6的高表达预示着GBM患者的不良预后,同时Fzd6亦能够通过加速细胞周期的G1/S期进展而促进GBM细胞的体内外增殖。3.Sortilin和Fzd6在GBM细胞膜和细胞浆内有明显的空间共定位,两受体在GBM细胞内有蛋白相互作用,Sortilin能够正向地调节Fzd6蛋白的表达。4.Sortilin和Fzd6能够在GBM细胞中发生细胞内化(由细胞膜转运至细胞质内),Sortilin能促进Fzd6的内化作用进而激活其下游Tak1分子。5.在GBM细胞中,Sortilin通过促进Fzd6分拣进入早期内含体和回收内含体维持着Fzd6内化-回膜循环。6.在GBM细胞中,抑制Sortilin功能能够促进Fzd6被分拣至晚期溶酶体内并发生蛋白降解,最终终止Fzd6的信号。7.体内实验,抑制Sortilin能够抑制Fzd6的表达和细胞内转运,进而减缓皮下和原位GBM移植瘤的生长。结论本研究首次提出Sortilin调节Wnt细胞通路受体-Fzd6的细胞内转运是促进GBM细胞增殖的重要的机制。证实了Sortilin可以作为GBM治疗的潜在靶点。