肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC,简称“肾癌”)是泌尿系统中致死性最强的恶性肿瘤。尽管近几年靶向药物显著改善了晚期肾癌患者的治疗结局,但其有效性非常有限。微小RNA (microRNA, miRNA)是一类经典的非编码RNA,具有长度短、作用广、稳定性强的特点,被认为是肿瘤治疗领域的“新靶标”。我们前期通过高通量microarray分析肾透明细胞癌(clear cell RCC, ccRCC)的癌组织及其癌旁组织的miRNA表达谱,发现miRNA在癌组织中以下调为主,其中miR-141下调最为明显。迄今,miR-141在肾癌中的作用及其机制缺乏全面而深入的研究。本研究旨在鉴定miR-141在肾癌中的临床价值和生物学作用及其机制,为将来运用于临床诊治提供理论依据。我们将通过检测多种肾肿瘤标本的miR-141表达水平,明确miR-141在肾癌诊断及预后判断中的价值；通过体内体外全面的功能研究,揭示miR-141在肾癌发生发展中的作用及其具体机制；通过ccRCC细胞培养液的分析,了解胞外miR-141的特性。本研究分为三部分：第一部分肾癌组织miRNA表达谱分析及miR-141临床价值鉴定目的：探索ccRCC癌组织和癌旁组织中miRNA的表达差异,筛选并鉴定可能在肾癌发生发展中起关键作用的miRNA(s)的临床价值。方法：用microarray生物芯片高通量分析ccRCC患者手术切除的癌组织及其癌旁组织中miRNA的表达情况,筛选出表达差异最明显的niRNA,运用实时定量PCR(qRT-PCR)在较大肾肿瘤样本组织中分析miRNA的临床意义。结果：按照倍数>2和P<0.05标准,我们发现相对于癌旁组织,44个miRNAs在ccRCC癌组织中下调,30个miRNAs上调。其中,miR-141在癌组织中下调最明显。qRT-PCR结果显示miR-141在92.6%(63/68)的ccRCC中明显下调(p<0.0001)。受试者工作特征曲线(ROC)分析显示miR-141鉴别ccRCC与正常组织的AUC(曲线下面积,即准确性)为0.93(95%CI,0.881to0.981)。癌组织中miR-141的表达水平与肿瘤分期、分级、大小均无统计学相关性。miR-141在肾癌细胞系和其他亚型肾肿瘤中也显著低表达,包括肾嫌色细胞癌(chRCC)、肉瘤样肾细胞癌和肾血管平滑肌脂肪瘤(AML)。结论：在肾癌发病中,miRNA异常表达以下调为主。miR-141可能作为鉴别ccRCC及正常组织有力的诊断标志物。miR-141的下调可能促进肾肿瘤的发生发展。第二部分胞内和胞外miR-141对肾癌细胞生物学特性的影响目的：通过体内体外研究,明确内源性miR-141在调控肾癌恶性活性中的关键作用,探索肾癌细胞胞外miR-141的生物学特性。方法：用慢病毒构建稳定高表达miR-141及其对照的肾癌细胞系,体外分析miR-141在肾癌细胞增殖(MTT)、周期(PI染色)、迁移侵袭(Transwell)、凋亡和药物敏感性(MTT和FACS)方面的调控作用；裸鼠原位肾肿瘤模型分析miR-141对肿瘤成瘤率、肿瘤大小、重量、局部侵袭率和远处转移率的影响；收集细胞培养液,提取RNA,qRT-PCR分析胞外miR-141的表达水平,并将含有miR-141的培养液培养对照细胞,观察其对受体肾癌细胞迁移侵袭能力的影响。结果：含有miR-141的慢病毒能显著提高786-0和SN12-PM6细胞中的miR-141表达水平,分别为400倍和2400倍。全面的功能研究显示,miR-141极大地抑制了肾癌细胞的迁移侵袭能力(p<0.0001),部分抑制细胞的生长(p<0.05),诱使细胞周期阻滞在Go/G1期,降低S期细胞数。然而,miR-141未能诱导肾癌细胞形态发生变化,对凋亡无直接促进作用,也未提高肾癌细胞对药物顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的敏感性。相对于对照组,过表达miR-141组的裸鼠肾肿瘤大小、重量明显降低。植入肿瘤细胞后6周和8-9周,miR-141组肾肿瘤未出现局部侵袭和远处转移,而对照组肿瘤明显向肾外侵袭性生长,多个脏器出现转移病灶。此外,带有miR-141的慢病毒感染肾癌细胞,可增加培养液中胞外miR-141的表达水平；胞外miR-141可进入受体肾癌细胞内,抑制受体细胞的迁移侵袭能力而对细胞增殖凋亡无明显影响。786-0和SN12-PM6细胞的胞外/胞内miR-141比值分别低于2.2%和0.01%。结论：通过抑制肾癌细胞的增殖和转移,miR-141可作为肾癌重要的抑癌基因。miR-141可分泌入细胞外,发挥细胞间的信息传递作用,但这种作用有限。第三部分在肾癌组织中高表达的EphA2是miR-141的一个新靶点目的：探索miR-141在肾癌中发挥抑癌作用的具体机制。方法：用Targetscan.miRanda、PicTar等多个靶点预测软件筛选miR-141的靶点,构建EphA23’UTR野生型和突变型荧光素酶报告基因,qRT-PCR、Western blot、IHC等方法在体外细胞水平、体内临床标本、裸鼠肾肿瘤标本分析EphA2和miR-141的表达水平。将EphA2siRNA转染肾癌细胞,分析敲除EphA2与过表达miR-141对肾癌细胞生物学功能影响的相似性。将EphA2siRNA和miR-141抑制剂共转染入肾癌细胞,设计“拯救”实验。查阅文献寻找与EphA2结构和功能相关的基因,Vestern blot分析过表达miR-141和敲除EphA2对肾癌细胞中FAK、p-FAK、AKT、p-AKT、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响。结果：多个靶点软件均预测到miR-141种子序列与EphA23’UTR相结合。双荧光素酶报告基因结果显示,过表达miR-141明显降低EphA23’UTR野生型的荧光素酶活性,而对突变型无明显影响。过表达miR-141的细胞和裸鼠肾肿瘤标本中的EphA2mRNA和蛋白水平明显下调。尽管ccRCC癌组织与癌旁正常组织中EphA2mRNA的表达水平无明显差异,但癌组织中EphA2mRNA与：miR-141的表达水平呈明显负相关(Pearson相关分析,R2=0.3661,p=0.0047)。更值得关注的是,EphA2蛋白在85%(17/20)的ccRCC中高表达。而且,敲除EphA2显著削弱肾癌细胞的增殖、迁移侵袭能力,阻滞细胞周期在Go/G1期,其作用与过表达miR-141的类似。miR-141抑制剂可以通过增加EphA2的表达增强肾癌细胞的迁移侵袭能力,该增强作用可被EphA2siRNA所中和。以往研究表明FAK和AKT是两个与EphA2结构和功能密切相关的基因,MMP-2和MMP-9是FAK和AKT的下游信号基因。据此,我们推测p-FAK/p-AKT/MMPs是miR-141-EphA2发挥抗癌作用的“效应器”。Western blot显示,过表达miR-141和敲除EphA2均能充分抑制肾癌细胞的p-FAK、p-AKT、MMP-2和MMP-9的表达,且miR-141抑制剂可增加FAK和AKT的磷酸化水平,该增加作用可被EphA2siRNA中和。结论：EphA2是miR-141的一个具有功能的直接靶点。EphA2在肾癌组织中高表达可能是由miR-141的缺失所致。miR-141-EphA2抑制肿瘤活性可能是通过p-FAK/p-AKT/MMPs通路实现的。