背景和目的：　　 血管性痴呆(Vascular dementia,VD)是指各种脑血管疾病引起的记忆和认知功能损害综合症。VD已被广泛认为是65岁以上年龄组人群中仅次于阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)的第二常见的痴呆类型。据统计,65岁以上的人群中有6％至10％患有痴呆症,而且这一比例随着年龄增加而上升。在美国,VD患者在所有痴呆病例中的比例约为30％；虽然AD仍是痴呆的最常见类型,有近5百万人,但是有60％的AD病人很可能同时患有VD。据我国11个城乡流行病学调查结果显示:60岁以上老人中,VD的患病率为324/10万人口,而AD为238/10万人口,VD的患病率在各类痴呆中排第一位。　　 近年来研究发现,VD是目前为止唯一可以预防的痴呆类型,早期治疗具有可逆性。不过目前在延缓VD病情发展、改善症状等方面现代医学收效仍然有限。因此更深入地探究VD发病的相关危险因素、发病机制、寻找新的早期诊断方法以及防治药物,己成为神经病学研究领域的重要课题之一。尤其开发有效防治VD的新药显得十分必要和紧迫。　　 丁基苯酞(Butylphathlide,NBP)是中国医学科学院药物研究所研发的新型抗脑缺血药物,其对急性缺血性脑卒中具有显著疗效。2002年9月被国家食品药品监督管理局(SFDA)批准为治疗急性缺血性脑卒中的一类新药。既往研究发现,NBP能通过改善缺血区局部脑血流及缺血脑组织的能量代谢,减轻线粒体的损伤,抑制神经细胞凋亡、炎症反应、自由基的产生、细胞内钙超载等来治疗脑缺血。而VD有四个常见病理类型:大动脉脑梗塞引起的痴呆、小动脉脑梗塞引起的痴呆、再发性脑梗塞引起的痴呆和低灌注引起的痴呆。脑出血可能会导致VD,但多数学者不视其为一个病理类型。由此看来,VD与脑缺血密切相关,而综合以往实验研究证明丁基苯酞对缺血性脑卒中确有较强的治疗作用,故大多数学者推测丁基苯酞对于VD应有较好的治疗效果,但尚缺乏直接的客观基础及临床证据,本课题正是利用行为学、病理形态学和免疫组织化学等多种方法对此进行了直接的相关动物实验方面的研究。　　 实验方法　　 1.VD大鼠模型的制作　　 选用健康成年雄性SD大鼠82只,采用Morris水迷宫定位航行实验筛选,淘汰学习记忆能力差的大鼠。将合格大鼠称重,排序,采用随机数字表法随机抽取9只为假手术组,其余用来制作VD模型。　　 本研究采用双侧永久性颈总动脉结扎(Permanent bilateral common carotidartery occlusion,2VO)法制作VD动物模型。　　 造模2月后,再次行水迷宫测试,每天4次,共5 d。记录第5 d逃避潜伏期。以假手术组大鼠逃避潜伏期的均值作为参考值,计算模型组各鼠平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠平均潜伏期的比,该值大于20％作为模型鼠痴呆标准纳入实验。　　 2.实验给药　　 将造模成功的VD大鼠按照各鼠逃避潜伏期的长短排序,根据随机数字表法随机分为:模型组、丁基苯酞治疗组、尼莫地平治疗组,每组9只。另加上假手术组9只,共4组36只。　　 造模2月后即灌胃给药,各组均连续灌胃2个月。根据动物与人体体表面积折算法,药物用量为人体用药剂量的20倍。丁基苯酞采用石药集团恩必普药业有限公司生产的丁苯酞软胶囊,生产批号为:09040211,预先在花生油中稀释,制成浓度为20 mg/mL的溶液备用,按80 mg/kg每日灌胃,尼莫地平采用拜耳医药保健有限公司生产的片剂,商品名尼膜同,研磨后先在花生油中稀释,制成浓度为5 mg/mL的溶液备用,按20 mg/kg每日灌胃。假手术组与模型组每日给予2 mL花生油灌胃。　　 3.VD大鼠学习记忆能力检测　　 各组均在灌胃2月后进行Morris水迷宫定位航行实验检测。记录第5 d逃避潜伏期。　　 4.病理标本采集与制备　　 各组大鼠水迷宫测试完毕后用10％水合氯醛腹腔注射麻醉,剂量为0.3mL/100 g,麻醉后立即开胸,使心脏暴露,将灌注针头插入心尖,剪开右心耳使静脉血完全放出,而后夹闭腹主动脉,只灌注头部、胸部及前肢。先灌注生理盐水约100 mL；待老鼠两前肢及两肺变白改灌注4％多聚甲醛固定液约80 mL,此时可见大鼠头颈及前肢明显抖动,直至颈部及前肢僵硬即表明灌注充分,继而断头取脑。再将脑置于4％多聚甲醛固定液中浸置4～6 h(4℃),而后取视交叉后2～6 mm至小脑前含海马区的脑组纵用PBS漂沈,经乙醇常规脱水、二甲苯透明后,浸蜡包埋。　　 5.HE染色　　 通过HE染色,光镜观察各组大鼠海马神经细胞的形态学变化。　　 6.Bcl-2、Bax蛋白表达免疫组织化学染色　　 应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase,SP)进行Bcl-2、Bax蛋白表达免疫组织化学染色,步骤如下:　　 ①蜡块5μm连续切片,捞片后放入烤箱,调至60℃烤12 h。　　 ②脱蜡至水。　　 ③滴加内源性过氧化物酶封闭液,室温孵育10 min,PBS充分淋洗。　　 ④热抗原修复。　　 ⑤滴加封闭用正常羊血清工作液,于室温下孵育10min,甩干。　　 ⑥滴加稀释(稀释比例均为1:100)过的兔抗鼠Bcl-2抗体、兔抗鼠Bax抗体,室温下孵育4小时,PBS液充分淋洗。　　 ⑦滴加生物素标记羊抗兔二抗工作液,室温下孵育10 min,PBS充分淋洗。　　 ⑧滴加辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的链霉亲和素,室温下孵育10 min,PBS充分淋洗。　　 ⑨加适量的3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(3,3’-Diaminobenzidinetetrahydrochloride,DAB)工作液,镜下控染。　　 ⑩苏木素轻度复染,水化,以使细胞核显示蓝色,同胞质中的DAB棕黄色形成对比。脱水,透明,中性树胶封片。显微镜下观察、计数,拍照。　　 7.统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。所有数据结果均以(x)±s表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)；方差不齐时,多重比较用Welch检验,两两比较采用Games-Howell法。P<0.05为差异有统计学意义。　　 结果　　 1.一般状况观察:2VO术后,多数大鼠在1 h左右意识开始逐渐恢复,但精神极度萎靡,只能爬行,反应迟钝,不思食水。术后24 h假手术组大鼠基本恢复正常饮食及行走,精神良好；造模大鼠仍然不能进食,反应亦较迟钝,行走不稳,部分大鼠仍只能爬行或转圈。3～5天后造模大鼠进食、精神、行走、反应逐渐恢复正常。　　 2.记忆能力测定结果:以大鼠逃避潜伏期代表记忆能力,逃避潜伏期越短,记忆能力越强。在给药2个月后,各组大鼠逃避潜伏期差异有显著性(F=26.104,P=0.000)。模型组、丁基苯酞治疗组、尼莫地平治疗组分别与假手术组比较大鼠逃避潜伏期皆显著延长(P<0.05)；但丁基苯酞治疗组、尼莫地平治疗组分别与模型组比较均显著缩短(P<0.05)；而丁基苯酞治疗组与尼莫地平治疗组之间比较无显著差异(P>0.05)。说明丁基苯酞能改善VD模型大鼠的记忆能力,且效果与尼莫地平相当。　　 3.各组大鼠形态学比较:光镜下观察,假手术组大鼠海马区神经元排列规则,胞质丰富,胞核较大。模型组大鼠海马区神经元大量变性、死亡,细胞体积缩小,周围出现空晕,胞浆浓缩、呈现深红色染色,核固缩、碎裂明显、深染。丁基苯酞治疗组、尼莫地平治疗组与模型组相比,海马区神经元变性、死亡明显减轻。而丁基苯酞、尼莫地平治疗组之间比较无明显差别。本实验HE染色结果表明丁基苯酞能改善VD大鼠海马神经元的病理形态,且改善程度与尼莫地平相当。　　 4.免疫组织化学检测结果:在40×10倍光镜下,每张切片随机选取3个视野,计数免疫反应阳性细胞数；以单个标本为单位,取平均值。Bcl-2(抗凋亡蛋白)、Bax(促凋亡蛋白)免疫阳性细胞质内均出现棕黄色颗粒(着色越深阳性反应越强)。假手术组海马区有少量Bcl-2、Bax免疫阳性细胞,着色浅。模型组较假手术组Bcl-2、Bax阳性细胞数均显著增加(P<0.05),着色增强；其中Bax增加更为显著,故Bax/Bcl-2比值上升,细胞趋向凋亡。丁基苯酞治疗组、尼莫地平治疗组分别与模型组比较,Bcl-2阳性细胞数均显著增多(P<0.05),着色进一步加深；而Bax阳性细胞数皆显著减少(P<0.05)、着色变浅。丁基苯酞治疗组与尼莫地平治疗组之间比较无显著差异(P>0.05)。提示丁基苯酞可以通过上调海马Bcl-2和下调Bax蛋白表达来抑制VD模型大鼠海马细胞凋亡,且调节强度与尼莫地平相当。　　 结论　　 1.丁基苯酞可显著改善VD大鼠认知水平,提高学习记忆能力,且效果与尼莫地平相当。　　 2.从细胞形态上显示,丁基苯酞能显著保护VD大鼠海马区的神经细胞,且改善程度与尼莫地平相当。　　 3.丁基苯酞可通过调节VD大鼠海马Bcl-2及.Bax蛋白表达,显著抑制神经细胞凋亡,保护神经细胞,且调节强度与尼莫地平相当。