研究背景癌症极大的威胁着人类的健康,前列腺癌是成年男性最常见的恶性肿瘤之一,在美国,其发病率居男性恶性肿痛首位,在我国,其发病率也逐年上升。在对前列腺癌治疗研究过程中存在着一些难题：包括前列腺癌诊断困难以及晚期前列腺癌特别是雄激素非依赖型前列腺痛缺乏有效的可靠的治疗方法。肿瘤的基因治疗策略是通过转入外源基因,激活胞内的相关凋亡通路进而诱导肿瘤细胞的凋亡达到消灭或缩小瘤体的疗效。肿瘤基因疗法一些优点包括靶向性强,对晚期肿瘤有效,全身治疗等。然而,基因治疗也存在着一些难题：凋亡难以持续激活,外源基因转入困难以及缺乏检测手段等。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是真核细胞信号传导的重要通路,其中p38作为该家族的亚族之一,参与了细胞内如应激反应、增殖、凋亡等多种生物学过程。在前列腺痛发生、发展的过程中,目前研究发现多种治疗基因通过p38MAPK通路诱导前列腺癌细胞凋亡。因此我们设计将外源性的p38MAPK导入细胞内,并使细胞稳定持续表达,观察该基因过表达时对细胞生长增殖的影响,同时为未来通过该通路的治疗靶点研究提供了工具。将外源基因转入宿主细胞并使其表达的过程中,外源性目的基因的携带载体选择成为最关键的技术环节。目前基因治疗中转入基因的载体大体上可以分为两大类：即病毒载体和非病毒载体。非病毒载体常用的方法包括电转移法、磷酸钙共沉淀法以及脂质体法,可以达到瞬时表达的效果。但瞬时表达系统的外源基因表达会随细胞生长繁殖而逐渐降低,且无法传至子代细胞。病毒载体目前常用的包括腺病毒载体,腺相关病毒载体以及慢病毒载体。其中慢病毒载体改造自逆转录病毒,具有以下特点：第一、慢病毒载体既能转导分裂细胞又能转导非分裂细胞；第二、目的基因高效的整合于宿主细胞基因组内实现长期而稳定的表达并可以传代给子代细胞；第三、不会引起宿主免疫反应；第四,去除了原病毒复制的关键位点,提高了生物安全性。对于前列腺癌的动物实验中,如何监测肿瘤细胞或者肿瘤组织的发生发展的过程成为亟待解决的问题,目前常见的方法包括荧光蛋白法和生物发光法。荧光蛋白作为报告基因,在生物学领域具有广泛的应用领域,成为细胞内分子影像的主流技术。其中远红色荧光蛋白(far-red fluorescent protein)因其激发和发射波长较长,细胞内成像背景低而成为生物发光研究领域的新热点。萤光素酶(luciferase)是一类在有O2及ATP存在下,催化特定底物产生生物荧光的酶的统称,其发光强度与肿瘤细胞数目、存活率而且与生长状态相关；最有代表性的是萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase, Flue),可准确定位肿瘤灶,作为报告基因提供了对肿瘤早期、快速、准确、动态的监测手段。综上所述,本文包括两个部分,第一部分是利用慢病毒载体技术,构建包含p38目的基因的慢病毒载体,建立稳定、持续表达p38蛋白的前列腺细胞株；第二部分采用慢病毒法构建表达双报告基因即：红色荧光蛋白-萤火虫荧光素酶(RFP-FLUC)的前列腺癌稳定细胞株,并探索其在构建裸鼠前列腺皮下模型中的应用。(一)p38丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用1.研究目的本研究将构建及鉴定p38MAPK基因重组慢病毒载体,包装慢病毒后转导前列腺痛DU145细胞株,建立稳定表达外源性EGFP/p38融合蛋白的人前列腺癌DU145单克隆细胞株EGFP/p38-DU145,初步探索p38对该细胞株生长的影响,从而为p38MAPK的功能及通过p38MAPK通路作用的相关基因的进一步研究提供工具。2.研究方法2.1慢病毒载体pTYF-EFlα-EGFP/p38构建及鉴定利用酶切、回收片段、再连接的方法构建慢病毒载体,将连接反应混合物转化大肠杆菌DH5a,挑取若干单克隆接种于特异性的抗性培养基中,提取重组载体质粒,以pEGFP/p38质粒作为对照,双酶切鉴定重组载体。2.2慢病毒包装和滴度测定按LipofectaminTM2000说明书psPAX2、pMD2.G及慢病毒载体(以pTYF-EF1α-EGFP载体作为对照)三质粒共转染293T细胞,转染48h后收集细胞上清,3000r/min4℃离心15min后于-80℃中保存病毒液。采用终点稀释法测病毒滴度(TU/ml).病毒滴度的计算公式为病毒滴度(TU/ml)=阳性细胞数×稀释倍数。2.3慢病毒转导DU145细胞向细胞内加入总体积300μ1,含100μl上述包装好的病毒上清(MOI=10)及polybrene (8μg/ml)的全培,24h后更换为500μl不含病毒液的全培,72h后观察细胞荧光发光。2.4单克隆细胞株的建立采用有限稀释法建立单克隆细胞株。96孔板中每孔加100μl含有单细胞的细胞悬液。常规培养20天后选取生长状态良好阳性克隆孔,然后逐级扩大培养。2.5Western blotting检测重组细胞株总p38的表达共纳入三种细胞：EGFP/p38-DU145细胞、EGFP-DU145细胞、正常DU145细胞RIPA裂解液裂解细胞后,收集上清于-20℃保存,常规方法对样品进行Western blotting检测。2.6细胞生长观察分别消化EGFP/p38-DU145细胞、EGFP-DU145细胞及正常DU145细胞,细胞计数后于24孔板内每孔接种1×104个细胞,每种细胞接种4块板,每板接种24个孔。之后每隔24h分别于各板内随机取3孔的细胞进行单盲计数并计算每板细胞数的平均值,连续计数8d后进行数据统计；利用3种细胞每天测量的细胞数的平均值绘制生长曲线。2.7统计学处理采用SPSS13.0统计软件,运用重复测量分析方法分别比较实验组EGFP/p38-DU145细胞与对照组EGFP-DU145细胞之间的生长速度是否具有统计学差异,P<0.05为差异有显著性。3.研究结果3.1慢病毒载体的鉴定慢病毒载体pTYF-EF1α-EGFP/p38经SalI和Nhel双酶切后在1%琼脂糖凝胶电泳中条带,其中可见大小约为1.7kb和5.5kb的条带,对照载体pEGFP/p38经双酶切后可见约1.7kb和3.0kb的条带,均与预计结果符合,证实载体构建成功。3.2慢病毒包装及滴度测定转染后24h,在荧光显微镜下观察几乎所有293T细胞均发出亮度较高的绿色荧光,利用终点稀释法稀释终点为105孔和106孔,计数两孔内分别共44和5个阳性细胞,故计算慢病毒滴度为(44×105+5×106)/2=4.7×106TU/ml。3.3慢病毒转导DU145细胞慢病毒转导DU145细胞72h后荧光显微镜白光下下观察其成上皮细胞形态,生长状态良好。在激发光下,部分整合了EGFP/p38融合基因的DU145细胞能发出绿色荧光,荧光较均匀的分布于整个细胞,慢病毒的转导效率较高。3.4单克隆稳定细胞株建立有限稀释法选取的一株细胞,成上皮细胞形态与正常的未经处理的DU145细胞在形态学上没有明显差异,其生长状态良好,所有细胞均发出绿色荧光,荧光较均匀地分布于整个胞浆。将其扩大培养后保存,命名为EGFP/p38-DU145。3.5Western blotting检测EGFP/p38-DU145细胞株总p38的表达三株细胞的内参表达量基本一致；在39kD附近,3株细胞均出现深浅程度相近的条带,说明3组细胞均表达内源性的p38蛋白,表达量没有明显差异；同时EGFP/p38DU145细胞株还出现了大小60kD左右的条带,为外源性的EGFP/p38融合蛋白,其表达量较高。3.6细胞生长观察较用同样方法转入外源EGFP基因的对照组EGFP-DU145细胞株,表达外源性p38的EGFP/p38-DU145细胞株生长速度明显减慢(P<0.05),说明过表达p38MAPK对于DU145细胞的增殖能力具有抑制作用。4.研究结论在本实验中,我们成功构建p38MAPK重组慢病毒载体并利用该载体技术转导DU145细胞；然后通过有限稀释法使细胞单克隆化,进而在荧光显微镜下选择荧光强度较高的单克隆株并通过Western blotting进行表达鉴定,得到了稳定、高效、均一地表达外源性p38的前列腺痛细胞株；发现过表达p38的DU145细胞尽管在细胞形态上没有发生显著改变,但其生长受到明显抑制,这种抑制作用因为p38蛋白的稳定过表达而长期存在。(二)慢病毒法建立稳定表达双报告基因的人前列腺癌细胞株1.研究目的建立同时稳定表达萤火虫荧光素酶(FLUC)和远红色荧光蛋白(RFP)双报告基因的人前列腺痛DU145细胞株,体外观察该细胞株生长特性及荧光素酶发光特性,继而利用该细胞建立裸鼠前列腺皮下瘤体模型,观察其体内成瘤后的生长及发光特性,为后续的研究工作提供良好的工具。2.研究方法2.1慢病毒包装及滴度测定按照LipofectaminTM2000的操作说明书,将载体psPAX2、载体pMD2.G及慢病毒载体plenti-cmv-Fluc-2A-mKate-cgk-puro三质粒共转染293T细胞,转染48h后收集细胞上清,3000r/min4℃离心15min后于-80℃中保存病毒液。采用终点稀释法测病毒滴度(TU/ml)。病毒滴度的计算公式为病毒滴度(TU/ml)=阳性细胞数×稀释倍数。2.2DU145细胞培养与puromycin最佳筛选浓度确定DU145细胞株常规培养并加入浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、6ug/ml的puromycin,设置3个复孔及空白对照,每天观察细胞形态变化,每2-3天更换含有上述浓度梯度的培养基。2.3慢病毒转导DU145细胞转导前1天取对数生长期状态良好的DU145细胞接种于24孔板中,转导时加入总体积300ul,含100ul病毒液(MOI=6)及polybrene (8ug/ml)的全培,24小时后更换为500ul不含病毒液的全培,72小时后观察细胞荧光发光。2.4单克隆细胞株的建立向转导后的DU145细胞添加并每2-3天更换含有浓度2ug/ml的puromycin的完全培养基,每天观察细胞形态及荧光发光情况,至大部分无抗性细胞死亡；然后利用有限稀释法挑选生长状态良好、荧光强度较高的阳性克隆孔,在含浓度2ug/ml的puromycin的完全培养基继续扩大培养。2.5阳性克隆细胞株体外生长及荧光素酶发光特性观察：取阳性克隆Fluc-mKate-DU145以及普通DU145细胞分别消化后计数,细胞计数后于24孔板内每孔接种1×104个细胞,每种细胞接种4块板,每板接种24个孔。之后每隔24h分别于各板内随机取3孔的细胞进行单盲计数并计算每板细胞数的平均值,连续计数8d后进行数据统计,利用2种细胞每天测量的细胞数的平均值绘制生长曲线。Fluc-mKate-du145细胞,以1×104-8×104个细胞每孔倍比稀释接种于96孔板中,在活体成像系统中观察单克隆细胞株发光特性,测量每孔相对光子数并比较与细胞数的关系。2.6裸鼠皮下移植瘤的建立共8只约六周龄的雄性裸鼠饲养于SPF级动物房内,随机分为实验组和对照组,每组4只做好标记；分别消化计数Fluc-mKate-DU145以及普通DU145细胞,并重悬于PBS内,每只鼠右侧臀部皮下注射100ul含有2×106个细胞的细胞悬液,其中实验组注射细胞为Fluc-mKate-DU145细胞,对照组为普通DU145细胞。动物饲养至2月时处死,解剖皮下移植瘤,制作病理切片并进行HE染色后于显微镜下观察。2.7瘤体体内生长观察及荧光素酶发光特性观察自肉眼可见的皮下肿瘤形成开始,每3天测量各只裸鼠皮下肿瘤的长径与短径计算肿瘤体积,同时在活体成像系统中观察其发光强度变化,至动物处死后停止观察。2.8统计学处理采用SPSS13.0统计软件,运用重复测量分析方法分别比较阳性克隆Fluc-mKate-DU145与对照组普通DU145细胞在体外生长速度是否具有统计学差异,P<0.05为差异有显著性；比较体外生长时发光强度与细胞数之间的相关性。3.研究结果3.1慢病毒包装及滴度测定三质粒共转染后24小时在荧光显微镜下观察细胞,几乎所有293T细胞均发出亮度较高的红色荧光,说明转染效率较高,病毒包装成功。经过抗生素筛选2周后,在10-5孔内共出现28个阳性克隆,10-6孔内共出现3个阳性克隆,故计算慢病毒滴度为(28*105+3*106)/2=2.9×106TU/ml。3.2慢病毒转导DU145细胞慢病毒转导DU145细胞72小时后荧光显微镜下观察成上皮细胞形态,生长状态良好。在激发光下观察细胞转导效率较高,整合了目的基因的DU145细胞能发出高亮度的红色荧光,荧光较均匀的分布于整个细胞,能较好地显示细胞的形态轮廓。3.3单克隆稳定细胞株建立有限稀释法铺板后20天,在96板中的挑选出的一株单克隆细胞群落,该株细胞生长状态较好,所有细胞均发出亮度较高的红色荧光,将其逐级扩大培养后保存,命名为Fluc-mKate-du145。3.4Fluc-mKate-du145细胞株体外生长观察及Fluc表达特性观察连续10天每天分别记录Fluc-mKate-du145及正常DU145细胞株的细胞数并取三个孔平均值,利用重复测量的方差分析得到两组细胞生长速度无显著性差异(p>0.1)。在活体成像系统(Xenogen IVIS TM Lumina Imaging system)中观察Fluc-mKate-du145发光情况,及各组的相对光子数测量值。利用相关分析,得出相对光子数测量值与细胞数呈线性关系(r=0.998,p<0.05)。3.5裸鼠前列腺癌皮下模型的建立及瘤体病理检测在第三周观察时,裸鼠皮下形成肉眼可见的肿瘤；动物处死时,大体观察,可见实验组与对照组肿瘤瘤体大小以及结构相似,HE染色后显微镜下观察瘤体细胞成典型的腺癌形态,与对照组相比没有明显差别。3.6皮下模型体内瘤体生长观察及荧光素酶发光特性观察皮下肿瘤体积随时间逐渐增大,活体成像系统中发现瘤体的发光强度随时间逐渐增加。4.研究结论本研究采用慢病毒技术,成功构建稳定表达Fluc-mKate双报告基因的激人前列腺痛DU145细胞株；体外观察,其荧光素酶发光强度与细胞数成正比,细胞的生长速度与普通DU145没有明显的统计学差别；在裸鼠皮下注射肿瘤细胞约20天后,形成肉眼可见的皮下痛体,其成长速度与对照组普通前列腺痛DU145细胞没有明显的统计学差异,常规病理切片观察其成腺癌组织形态,恶性程度与对照组相近,荧光发光强度随时间不断增加,为前列腺癌的动物实验提供良好的研究模型。