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穴位是经络气血输注出入于体表和临床针刺施术的特定部位,是脏腑疾病的反应点和治疗疾病的刺激点。经络是经脉与络脉的统称,是人体气血运行的通路,它以一种完全不同于现代医学和生物学理论的方式来阐述人体机能调控的机理和生命过程,有效地指导着中医各科,尤其是针灸的临床实践。穴位与经络理论是针灸学的基础,是中医理论的重要组成部分,也是中医现代化必须要解决的一个重要科学问题,深入研究穴位和经络可以阐明穴位的作用机理,认识其功能,提高其疗效。全面科学地解释穴位和经络理论对于沟通传统中医理论和现代医学也有重要意义。近半个世纪以来,随着科学尤其是生命科学的进步,人们对腧穴、经络理论进行了广泛而深入的研究,取得了大量的研究成果,证明了经络(现象)存在的客观性,但关于穴位实质和结构的各种解释和假说却很难统一并完整解释经络腧穴问题。既往有关穴位与神经相关性的研究已证实神经和感受器同穴位和经络有密切关系,但以往的研究主要是从某一穴位入手,观察穴区局部的形态学特征或与神经节段及神经网络的关系,很难从整体上解释穴位和经络问题。由于穴位是一种固有的生命现象,根据生物由低等向高等进化的原理,推测低等动物亦应存在穴位或类似结构,我们以往的研究也表明,鱼类体表感受器存在类穴位和类经络样分布,所以本研究从鱼类体表感受器入手,以锦鲤为实验动物,通过对其体表感受器形态、分布规律观察以及HRP示踪研究,来探讨其与穴位和经络的关系,以期运用比较生物学的方法,探讨穴位存在的生物学证据。实验一:锦鲤体表类穴位结构的形态学观察1实验动物锦鲤(Cryprinus carpiod)12条,其中体长(4.0±0.42)cm者6条,体长(8.1±0.64)cm者6条,雌雄不拘,自观赏鱼市场购回后置于鱼缸中喂养2周备用。2实验方法将锦鲤(体长＜4.0±0.42＞cm)放入30μM荧光染料DiA水溶液中1小时,再放入自来水中30分钟,然后经2%乙醚水溶液麻醉,在荧光显微镜下用B-2A组合滤光镜观察荧光标记并拍照,用图像分析处理软件抓拍拼接大图。此方法主要用于观察锦鲤类穴位结构在体表的整体分布和排列规律。将锦鲤(体长＜8.1±0.64＞cm)放入30μM荧光染料DiA水溶液中7天,再放入自来水中1小时,然后经2%乙醚水溶液麻醉,必要时将部分鱼鳞向后拔掉(尽量不损伤鱼鳞间皮肤)以观察神经纤维走向,在荧光显微镜下用B-2A组合滤光镜观察荧光标记并拍照,依据观察结果绘制模式图。此方法主要用于观察锦鲤类穴位结构的微观结构及神经走向和联系。3实验结果3.1通过对锦鲤(体长＜4.0±0.42＞cm)体表类穴位结构的整体荧光观察,可以发现锦鲤体表有类穴位样结构分布见图1,其排列有明显规律:(1)荧光标记物在体表成簇状分布,每簇数量不等。(2)标记物在目周成放射状,且沿鳃盖前后沿有线性分布。(3)标记物在体干部呈明显的线性排列,共约14条。(4)体干中较明显的管状结构为侧线管,其内亦有标记物出现。3.2通过对锦鲤(体长＜4.0±0.42＞cm)体表类穴位结构的个体荧光观察,可以进一步发现其结构构成,标记物簇内各感受器间有神经纤维相连,并汇合成一支趋向吻侧。体表感受器与侧线内感受器在形态上有所区别。3.3经DiA长时间(7天)浸染的锦鲤(体长＜8.1±0.64＞cm)拨掉局部鱼鳞后在荧光镜下观察,可清楚观察与体表感受器相连的神经纤维的走向及联系。实验二:锦鲤体表类穴位结构的HRP示踪研究1实验动物实验用锦鲤(体长12.2±0.62)cm 30条,雌雄不拘,自观赏鱼市场购回后置于鱼缸中喂养2周备用。2实验方法锦鲤经2%乙醚水溶液麻醉后,用微量进样器抽取30%的HRP溶液分别注射于体表的11个有代表性的注射点,注射前将注射处神经纤维用针尖划断,每条鱼注射一处,每处缓慢注射5-6μl。锦鲤存活36-48小时,继用2%乙醚水溶液麻醉,固定于固定装置上,暴露心脏,通过动脉圆锥插管灌流固定,次日冰冻切片,片后3μm,用TMB显色。显色反应后,酒精梯度脱水,二甲苯透明,树脂封片,在显微镜下观察实验结果。3实验结果通过对实验全部阳性结果的观察,发现阳性细胞均出现在面神经核,绝大多数注射点阳性细胞出现在同侧面神经核区域,少数(1例)在两侧面神经核都出现阳性细胞。结论本实验分别用活体荧光观察和HRP示踪的方法,首次系统观察了锦鲤体表感受器在体表的分布规律,发现了其簇状分布和线性排列的体表分布特征。HRP示踪的结果显示,锦鲤体表感受器主要投射到面神经核,其信息可以在面神经核进行汇聚和整合,并进一步与中枢神经的其他核团发生联系,互相影响,进而通过传出神经影响身体的功能。综合实验一和实验二的结果可知,体表感受器及其神经纤维在体表形成了一个以纵行神经纤维为主体的神经感受网络。体表感受器在体表的簇状分布和线性排列非常类似于中医针灸中的穴位与经络,其神经纤维趋向于侧线、头部方向,并集中入脑投射于小脑与延脑迷叶间面叶深部的面神经核,进而与中枢神经的其他核团发生联系。这种体表感觉网络有其自身的系统性和完整性,其先纵行传导,再集中入脑的信息传导方式与经典神经理论的先按节段进入中枢再纵向传导的方式有根本的不同,无疑前者的信息传递方式同经络的传导方式更接近。所以,我们认为深化对鱼类体表感受器的研究对我们进行穴位与经络研究或有一定的借鉴和启发意义。