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目的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种人类常见的条件致病菌,金黄色葡萄球菌感染者往往病情较重、死亡率较高。近年来金黄色葡萄球菌的耐药率不断增高,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素金黄色葡萄球菌（VRSA）的出现,导致临床治疗越来越困难,除了科学合理使用现有抗菌药物,寻求新的补充或替代策略是亟待解决的临床问题之一。20世纪80年代以来,为应对全球范围内抗菌素耐药的严峻形势,古老的噬菌体疗法再次引起研究者的关注,多项基础与临床研究显示了良好的应用前景,为耐药菌的治疗提供了新思路和新策略。除了传统的噬菌体疗法,以裂解酶为代表的噬菌体衍生物的研究也受到了广泛关注,拓展了噬菌体治疗的技术方法,提高了临床应用的可行性。在本课题组前期研究鲍曼不动杆菌噬菌体和肺炎克雷伯菌噬菌体及其解聚酶的基础上,以临床分离的一株多重耐药性金黄色葡萄球菌Sa35为宿主菌,从解放军总医院第五医学中心南院区未经处理的污水中分离到一株裂解性噬菌体IME522,对其裂解酶及穿孔素基因编码的蛋白进行预测和生物信息学分析、克隆表达和抗菌活性研究,为耐药性金黄色葡萄球菌感染的噬菌体相关治疗提供理论依据。方法以金黄色葡萄球菌噬菌体IME522为研究对象,首先使用Pfam数据库、NCBI保守域数据库（CDD）、Signal P 4.0 Server、CLC Genomics Workbench 3.6.1、TMHMM Server v.2.0等软件对ORF4进行生物信息学分析和功能预测。然后用PCR方法扩增噬菌体IME522的裂解酶（ORF4）基因,通过同源重组无缝克隆技术与PET-28a表达载体构建重组质粒。诱导裂解酶蛋白表达,SDS-PAGE与Western blot鉴定裂解酶分子大小,点板法初步验证裂解酶活性,亲和层析法纯化蛋白。对裂解酶进行体外杀菌实验,比较裂解酶对对数期与平台期细菌的杀菌能力,测定不同温度、p H值对裂解酶活性的影响,通过点板法测定裂解酶裂解谱,结晶紫染色和扫描电镜观察裂解酶对金黄色葡萄球菌Sa35生物被膜的清除能力,棋盘法测定裂解酶与万古霉素联合杀菌的最小抑菌浓度,时间杀菌试验测定裂解酶与万古霉素联合杀菌的速率,评估裂解酶对红细胞的溶血作用及对人体细胞的毒性作用。双链DNA噬菌体通常使用穿孔素-裂解酶（holin-endolysin）裂解系统来实现对细菌宿主的裂解。对编码穿孔素蛋白的基因进行预测,然后对穿孔素进行生物信息学分析、克隆及蛋白表达,测定穿孔素在诱导过程中对大肠杆菌BL21（DE3）生长速度与活力影响,Western blot验证穿孔素蛋白分子大小,点板法、涂板计数和刃天青染色测定穿孔素对金黄色葡萄球的抗菌作用,并对穿孔素与裂解酶的裂解谱进行比较。结果蛋白结构与功能分析裂解酶包括CHAP、酰胺酶两个催化结构域和一个SH3b结合结构域。重组裂解酶经过SDS-PAGE与Western blot验证其大小正确,并且可以在铺有金黄色葡萄球菌Sa35的双层琼脂平板上形成透明晕环,具有良好的抗菌活性,将该裂解酶被命名为LysP4。LysP4对金黄色葡萄球菌Sa35有很强的杀菌作用,可以减少对数期菌3 log CFU/m L,减少平台期细菌约2 log CFU/m L。LysP4在p H 5.0-10.0,温度16-40℃裂解活性较强。金黄色葡萄球菌Sa35生物被膜形成能力较强,结晶紫染色和扫描电镜观察到LysP4可以有效清除生物被膜而杀死细菌。LysP4对红细胞的溶血作用及对人体细胞的毒性实验表明,LysP4不会导致红细胞溶血,也不会对胚肾细胞、肺癌细胞的生长造成影响。LysP4与万古霉素联合杀菌结果显示最小抑菌浓度分别由单独作用的64μg/m L,2μg/m L降低为4μg/m L,0.5μg/m L,时间杀菌曲线表明协同杀菌效果更好,减少细菌数量4 log CFU/m L,而单独的LysP4（4μg/m L）只减少细菌数1 log CFU/m L,单独的万古霉素（0.5μg/m L）没有杀菌作用。蛋白结构分析穿孔素与穿孔素家族蛋白Phage＿holin＿1有很高同源性,存在2个疏水性跨膜结构区域,属于II类穿孔素。穿孔素在诱导表达时会导致大肠杆菌BL21（DE3）的生长停滞甚至裂解。点板法、刃天青染色、涂板计数验证穿孔素蛋白对金黄色葡萄球菌Sa35有裂解活性,将该穿孔素命名为HolP3。测定穿孔素HolP3和裂解酶LysP4的裂解谱,7种不同MLST分型（1、22、25、59、239、398、509）的金黄色葡萄球菌,只有239这一种MLST分型不能被裂解,其他6型均能裂解。10株伪中间型葡萄球菌,穿孔素裂解5株,裂解酶裂解10株。13株表皮葡萄球菌,穿孔素裂解8株,裂解酶裂解7株。穿孔素可以裂解血清型O16:H48的大肠杆菌,裂解酶不能裂解大肠杆菌。结论1.本研究以金黄色葡萄球菌噬菌体IME522裂解系统为研究对象成功克隆表达了裂解酶LysP4与穿孔素HolP3。2.LysP4对金黄色葡萄球菌有很强的杀菌作用,在p H值5.0-10.0,温度16-40℃稳定性好。LysP4可以有效清除金黄色葡萄球菌表面生物被膜,与万古霉素联合具有协同杀菌作用,LysP4与抗生素联合,可以减少抗生素使用剂量。LysP4对人体红细胞无溶血作用,对胚肾细胞、肺癌细胞无毒性作用,裂解酶作为蛋白制剂临床应用的安全性得到保证。3.IPTG诱导穿孔素表达时会导致大肠杆菌BL21（DE3）的裂解,HolP3对金黄色葡萄球菌Sa35有裂解活性。穿孔素是小分子膜蛋白,存在2个疏水性跨膜结构区域。4.穿孔素HolP3和裂解酶LysP4的裂解谱相似,对葡萄球菌属裂解范围均很广,并且穿孔素可裂解EDTA处理过的血清型O16:H48大肠杆菌。