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赤狐和银黑狐是狐属毛皮动物,具有显著不同的毛色。银黑狐是赤狐在自然条件下的毛色突变狐,这种毛色变异的分子机理至今未明。毛色是影响狐皮价格的重要因素,是狐的重要经济性状,也是重要的育种目标。研究狐的毛色变异为培育新毛色品种狐提供了重要的理论基础和技术支持。挖掘毛色相关基因,研究毛色形成的信号通路,探索毛色变异的分子机理,推动毛皮动物的分子育种研究,加快新品种狐的培育。本试验选用赤狐和其毛色突变狐——银黑狐作为研究对象。开展的试验有:一是分析赤狐和银黑狐被毛中黑色素的组分和含量,同时从染色体核型的角度研究这两种狐的差异。二是采用RNA-seq对赤狐和银黑狐体侧部皮肤组织进行高通量测序,利用生物信息学手段分析挖掘这两种狐皮肤组织的差异表达基因,并通过生物信息学手段筛选与色素形成密切相关的差异表达基因和信号通路。三是利用Small RNA测序技术筛选赤狐和银黑狐体侧部皮肤组织的差异表达的miRNAs,对其靶基因进行预测和分析,并对靶基因进行通路富集。四是对候选色素基因MC1R、MITF和TYRP1进行分子克隆,获取其CDS序列,并构建系统进化树,还通过生物信息学数据库和软件预测其编码蛋白的结构和功能。五是建立分离和体外培养狐皮肤黑素细胞的技术程序。六是构建TYRP1-PiggyBac载体,过表达差异表达基因TYRP1,研究其在体外培养的黑素细胞中的功能,为后续研究毛色相关基因和miRNAs的功能提供技术支持。主要研究结论如下:1.狐皮肤组织切片表明狐皮肤毛囊是复合毛囊,三毛囊群占大部分。狐被毛的色素含量分析表明银黑狐被毛的总黑色素含量极显著高于赤狐被毛的总黑色素含量(p<0.01);银黑狐被毛的真黑色素含量极显著高于赤狐被毛的真黑色素含量(p<0.01);银黑狐针毛、绒毛的真黑色素含量显著高于赤狐针绒毛的真黑色素含量(p<0.05)。银黑狐和赤狐其他类型毛的总黑色素、真黑色素和棕黑色素含量均无显著差异(p>0.05)。2.赤狐和银黑狐的染色体无明显差异,染色体数均为2n=32+X,Y,有0-4个B型染色体,中央着丝粒染色体(M)有12对常染色体和X染色体,亚中央着丝粒染色体(SM)有4对常染色体和Y染色体。3.经RNA-seq测序分析表明:与色素形成紧密相关的受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶U(PTPRU,protein tyrosine phosphatase,receptor-type,U)上调表达,酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)下调表达,暗示着PTPRU和TYRP1在赤狐和银黑狐毛色变异中有着重要作用。差异显著的信号通路有细胞外基质受体互作通路(ECM receptor interaction)和酪氨酸代谢通路(Tyrosine metabolism)。此外,PTPRU在膜内区域含有与Cadherins高度保守同源结构域juxtamembrane,暗示着PTPRU通过其Juxtamembrane域与β-catenin相互作用,传递细胞信号,从而参与调控狐的毛色变异。4.Small RNA测序筛选出差异表达miRNAs共23个,其中上调表达16个,下调表达7个。上调表达的miR-125b和miR-145在赤狐和银黑狐毛色变异中有着重要的作用。筛选到与色素形成密切相关的靶基因富集信号通路共8条,分别为:TGF-beta signaling pathway、Endocytosis、Lysosome、Cysteine and methionine metabolism、Tyrosine metabolism、Phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis、Phenylalanine metabolism、Glutathione metabolism。5.银黑狐MC1R的CDS序列954bp,是7次跨膜蛋白,含有3个糖基化为点,3个磷酸化位点和1个G蛋白耦联受体信号位点,广泛磷酸化位点6个,T-157位是特异性磷酸化位点;银黑狐MITF的CDS序列1260bp,非膜结合蛋白,含有9个蛋白激酶磷酸化位点和1个亮氨酸拉链结构域,广泛磷酸化位点26个,T-38位是特异性磷酸化位点;银黑狐TYRP1的CDS序列1614bp,是2次跨膜蛋白,含有8个糖基化位点,17个蛋白激酶磷酸化位点,2个生长因子样结构域位点,2个Cu结合位点,广泛磷酸化位点27个,T-128位是特异性磷酸化位点。这三个色素基因均可用于物种亲缘关系分析。6.建立了从狐皮肤组织分离黑素细胞,并进行原代培养、纯化培养、细胞冻存和复苏等技术优化,成功地培养了狐皮肤黑素细胞。7.构建了TYRP1-PiggyBac过表达质粒载体,并成功转染了体外培养的黑素细胞,建立了在体外研究色素相关基因和miRNAs功能的技术平台。