论文部分内容阅读
肌内脂肪是影响猪肉品质的重要因素,长期以来,对高瘦肉率的持续选育使得猪肉肌内脂肪含量不断降低,从而影响了猪肉的风味和品质。可见,提高肌内脂肪含量是改善猪肉品质的主要途径,而肌内脂肪沉积的组织特异性机制则是调控肌内脂肪含量的理论基础。与皮下脂肪相比,肌内脂肪具有独特的组织学特征,其主要分布于肌纤维之间,因此肌肉组织旁分泌效应及其组织微环境对肌内脂肪的发育有着重要影响。因此,明确肌肉组织对脂肪组织脂质代谢的调控效应是阐明肌内脂肪沉积机制的前提。胰岛素信号对脂肪沉积具有重要的调控作用,能够诱导前体脂肪细胞分化,促进成熟脂肪细胞合成甘油三酯并抑制其分解。本研究首先比较了肌内脂肪细胞与皮下脂肪细胞胰岛素信号差异;进而采用肌肉条件培养基处理脂肪细胞,以此探讨了肌内脂肪细胞中胰岛素信号的特异性调控机制,及其对脂质代谢的影响;最后,分析了候选基因和肌肉分泌因子对脂肪细胞胰岛素信号和脂质代谢调控机制,阐述了影响猪肌内脂肪细胞发育的具体调控方式。具体试验结果如下:1.肌内与皮下脂肪细胞胰岛素信号敏感性存在差异采用“天花板”法分别采集肌内和皮下前体脂肪细胞,并对前体脂肪细胞标记蛋白Pref-1进行免疫荧光染色鉴定。结果显示:两种前体脂肪细胞都具有良好的增殖、分化能力,Pref-1蛋白呈阳性表达,证实所采集的前体脂肪细胞具有较高的纯度。为检测胰岛素(insulin)信号对脂肪细胞分化的影响,用insulin分别处理皮下前体和分化的脂肪细胞、siRNA分别抑制insulin作用受体INSR和IGF-1R表达,检测insulin信号的改变对细胞分化表型的影响。结果显示:insulin无法诱导前体脂肪细胞分化,但可以促进地塞米松(Dex)和3-甲基-1-丁基黄嘌呤(IBMX)对细胞诱导分化的效应(p<0.05);insulin处理分化的脂肪细胞后,细胞中的脂滴变大,同时甘油三酯含量增加、脂肪细胞标记基因FABP4和PPARG的表达水平升高(p<0.05);抑制细胞中INSR/IGF-1R的表达,细胞分化后甘油三酯合成减少,分化水平显著降低(p<0.01)。为探究肌内与皮下脂肪细胞insulin信号和脂质代谢差异,比较了两种细胞INSR/IGF-1R表达水平和分化表型,并检测了细胞中葡萄糖代谢和脂肪酸转运相关基因的表达水平。结果显示:INSR和IGF-1R在肌内脂肪细胞中的表达水平显著高于皮下脂肪细胞(p<0.01);细胞分化后,肌内脂肪细胞中甘油三酯合成量、成熟脂肪标记基因FABP4和PPARG的表达水平显著低于皮下脂肪细胞(p<0.01);葡萄糖转运关键基因Glut1和Glut4(p<0.05)和糖酵解关键基因PKM2和PDK4(p<0.05)分别在肌内脂肪细胞分化前期和后期表达较高,而脂肪酸转运关键基因FAT和LPL在皮下脂肪细胞分化后期表达较高(p<0.05);为阐明肌内与皮下脂肪细胞成脂能力的差异,比较了两种细胞的脂肪酸氧化能力和线粒体功能差异。结果显示脂肪酸氧化关键基因Cpt-1α、Cpt-1β和PPARα在肌内脂肪细胞中的表达水平显著高于皮下脂肪细胞(p<0.05);线粒体DNA拷贝数(p<0.05)以及线粒体增生相关基因NRF-1、TFAM、PGC-1α(p<0.01)在肌内脂肪细胞中的表达水平显著高于皮下脂肪细胞。2.肌肉条件培养基增强肌内脂肪细胞insulin信号并抑制细胞分化为探究肌内脂肪细胞的发育受肌肉组织调控,用不同浓度肌肉条件培养基(MCM)处理皮下前体脂肪细胞后测定细胞增殖、凋亡和分化表型的变化。结果显示:MCM抑制了细胞增殖,且蛋白浓度为120μg/ml时效果最显著(p<0.01);凋亡检测进一步表明120 μg/ml MCM促进了细胞凋亡,早期和晚期凋亡率分别从6.5%、2.8%上升到15.1%(p<0.01)、6.4%(p<0.05);油红O染色结果表明MCM抑制脂肪细胞分化,细胞油红O阳性脂滴含量显著减少,蛋白浓度为120 μg/ml时效果最显著。为检测肌肉组织对肌内脂肪细胞胰岛素信号的影响,用120 μg/ml MCM处理皮下前体脂肪细胞,测定insulin信号相关基因的表达变化。结果显示:MCM处理后IRS-1 mRNA水平显著升高(p<0.01),蛋白印迹结果显示:IGF-1R、IRS-1和p-IRS-1(Tyr)的蛋白表达水平都显著升高(p<0.05)。为进一步验证MCM对细胞insulin信号的影响,用MCM处理不同分化阶段的脂肪细胞,结果显示MCM显著提高了早期到中期分化阶段细胞的INSR、IGF-1R、IRS-1和p-IRS-1(Tyr)表达水平(p<0.05)。为检测insulin信号改变的同时细胞分化表型的变化,用120 μg/ml MCM处理不同分化阶段的脂肪细胞,进一步检测细胞分化表型的变化。结果显示MCM抑制细胞分化,且主要在初期到中期分化阶段起作用,表现为甘油三酯含量减少、脂肪细胞标记基因FABP4和PPARG的表达水平显著降低(p<0.05)。NCOA3能够调控机体脂肪组织的发育和胰岛素敏感性,qPCR定量和蛋白印迹结果发现MCM抑制了 NCOA3 mRNA和蛋白表达水平(p<0.05)。为进一步阐明MCM抑制细胞脂质沉积的原因,检测了 MCM对细胞脂解、脂质合成和脂肪酸氧化相关表型的影响。结果显示:MCM处理组脂肪酸氧化基因(Cpt1α、Cpt1β和PPARα)、产热关键基因(PGC-1α、PRDM16和Cidea)、线粒体的DNA的拷贝数、线粒体增生相关基因(PGC-1α,NRF-1和TFAM)的表达水平显著高于对照组(p<0.05)。3.肌肉条件培养基通过miR-17-5p调控NCOA3影响肌内脂肪细胞insulin信号和分化水平上述研究表明MCM能够抑制NCOA3的表达,已有的报道显示抑制NCOA3表达能够提高脂肪组织的胰岛素敏感性,我们推测NCOA3在肌内与皮下脂肪组织差异表达可能是引起这两种组织insulin信号和脂肪差异沉积的原因,为此比较了这两种组织中NCOA3的表达水平,筛选鉴定了靶向调控NCOA3的miRNA,并探索miRNA调控NCOA3的机理,最后通过在肌内脂肪细胞中分别转染miRNA mimic和inhibitor验证其对细胞分化的影响。RT-qPCR结果显示:NCOA3在肌内脂肪组织中的表达水平显著低于皮下脂肪组织(p<0.01);NCOA3肌内和皮下脂肪组织中的表达比值(NCOA31/NCOA3s)在IMAT/SCAT高组个体中较高(p<0.05)。使用RT-qPCR检测可能靶向调控NCOA3的miRNAs(数据库预测),结果表明只有miR-17-5p在肌内脂肪组织中的表达水平显著高于皮下脂肪组织(p<0.01),且miR-17-5p肌内和皮下脂肪组织中的表达比值(miR-17-5pI/miR-17-5ps)在IMAT/SCAT高组个体中较低(p<0.05)。进一步通过双荧光报告实验、RT-qPCR和蛋白印迹试验证明miR-17-5p能够靶向调控NCOA3。为验证肌肉组织的旁分泌效应是引起miR-17-5p在肌内与皮下脂肪组织差异表达的原因,用MCM处理皮下前体脂肪细胞后,测定miR-17-5p的表达水平。定量结果显示:MCM处理组miR-17-5p表达水平显著高于对照组(p<0.05)。将miR-17-5p mimics和inhibitor分别转染到肌内前体脂肪细胞,24 h后诱导其分化,10天后检测结果显示:miR-17-5p mimics转染组脂肪细胞标记基因FABP4和PPARG的表达水平显著降低,甘油三酯含量显著减少(p<0.05);而miR-17-5p inhibitor转染组脂肪细胞标记基因FABP4和PPARG的表达显著升高,甘油三酯含量显著增加(p<0.05)。4.肌肉分泌因子FGF21诱导白色脂肪细胞棕色化基于肌内脂肪具有部分棕色脂肪的特性,而肌肉分泌因子FGF21能够调控细胞insulin敏感性并诱导白色脂肪细胞棕色化,我们以FGF21为候选基因,研究了其介导肌肉组织调控肌内脂肪细胞的作用。首先检测了猪肌肉组织与脂肪组织中FGF21的表达水平以及MCM中FGF21的浓度,结果显示FGF21在肌肉组织中的表达水平极显著高于皮下脂肪组织(p<0.01),MCM中FGF21浓度显著高于血清中的(p<0.01)。为进一步检测肌肉分泌因子FGF21对脂肪细胞脂质代谢和insulin信号的调控作用,用FGF21分别处理分化中和成熟脂肪细胞,测定细胞分化表型的变化。结果显示FGF21处理分化中的脂肪细胞细胞9天后,细胞甘油三酯合成量减少、脂肪细胞标记基因FABP4和PPARG的表达水平显著降低(p<0.01),但细胞分化水平没有明显变化;FGF21处理成熟脂肪细胞3天后,insulin信号相关基因INSR、IGF-1R和IRS-1、脂解关键基因ATGL和HSL的表达水平显著升高,甘油的释放量增加(p<0.05)。为阐明FGF21对脂肪细胞insulin敏感性的影响,检测了 FGF21处理对脂肪细胞葡萄糖消耗的影响。结果显示:FGF21处理组葡萄糖消耗量显著高于对照组(p<0.05),在insulin和FGF21共同作用下,细胞对葡萄糖消耗量显著高于insulin处理组(p<0.01)。为检测FGF21对猪脂肪细胞棕色化的效应,用FGF21培养皮下脂肪细胞6天后测定棕色脂肪细胞标记基因的表达水平,RT-qPCR结果显示FGF21处理组棕色脂肪标记基因 PPARα、Cidea、PRDM16、Elovl3、PGC-1α、CPT-1α 和 CPT-1β 的表达水平均显著升高(p<0.05)。综上所述,通过比较肌内与皮下脂肪细胞胰岛素信号和成脂分化水平的差异,继而检测肌肉条件培养基对脂肪细胞胰岛素信号和成脂分化的调控效应,为探究肌肉组织对肌内脂肪发育的调控机制提供理论基础,同时为提高肌内脂肪改善猪肉品质提供理论指导。