随着抗生素长期大量应用(包括滥用)，细菌耐药菌株随之大量出现，已成为感染性疾病治疗缺乏疗效的难题之一。细菌的耐药性引起了医学界及社会的极大关注，成为全球普遍关心的公共卫生问题，而搞清细菌耐药机制被认为是克服细菌耐药性的关键之一。 铜绿假单胞菌因其内在特点，对多种抗菌药物表现出天然或获得性耐药。因此，铜绿假单胞菌耐药株可作为研究细菌耐药的分子机制，研究开发抗耐药细菌药物的模型菌株。本研究首先从128株铜绿假单胞菌临床分离株中，获得大量对喹诺酮类药物耐药菌株；接着对耐药株Ⅱ类拓扑异构酶基因突变与耐喹诺酮类药物的关系，MexAB-OprM主动外排系统oprM结构基因的表达，mexR调节基因在MexAB-OprM外排系统中的作用以及gyrA基因突变与MexAB-OprM主动外排在细菌生物膜耐药机制中的作用等进行了较为深入的研究。通过对铜绿假单胞菌耐药的分子机制一步步的深入研究，无疑将加深人们对细菌耐药性理解。这对于合理使用抗菌药物，寻找抗菌药物作用的新靶点，指导研究开发新的抗菌药物，解决细菌耐药性问题等都具有重要意义。 128株铜绿假单胞菌临床分离株对常用抗菌药物的耐药性研究表四川人学博卜学位论文针J绿假单胞耐哇诺酮类药物的分了机制研究明:铜绿假单胞菌对头饱曲松、诺氟沙星和环丙沙星的耐药率高达69.5%、57.8%和26.6%。其中，有17株对四种喳诺酮类药物呈交叉耐药，占临床分离株的13.3%;13株对实验所用的抗菌药物表现出多重耐药性，占临床分离株的10.2%。可见铜绿假单胞菌临床分离株耐药的严重性。 用微量棋盘稀释法对哇诺酮与p一内酸胺类药物联合用药研究显示，左氧氟沙星、环丙沙星与头饱他咤、呱拉西林联合用药对大多数临床分离铜绿假单胞菌具有协同或相加作用，其抗菌活性明显增强。因此，抗假单胞菌的p一内酞胺类药物与喳诺酮类药物联合用药治疗铜绿假单胞菌感染是切实可行的。 对20株铜绿假单胞菌环丙沙星耐药株(从128株铜绿假单胞菌临床分离的环丙沙星耐药株中按每一MIC浓度梯度随机挑选3株)H类拓扑异构酶舒rA、岁rB、parC和parE基因的哇诺酮药物耐药决定区基因突变与耐药性关系研究结果显示，90%的耐药株H类拓扑异构酶基因发生了突变(20株中有18株)。突变主要发生在舒rA基因(18株)和parC基因(10株)上，其中，了A基因的第83位氨基酸密码子表现出高频突变(17株，ACC一ATC，占耐药突变株的94.4%)，只有2株耐药株的多?B和parE基因分别发生单点突变。而发生2个以上基因突变的变异株大都是高水平耐药株。在这些n类拓扑异构酶基因突变耐药株中，有4株对所有试验的喳诺酮和p一内酞胺类药物都表现出高水平的耐药。表明这些耐药株，除11类拓扑异构酶基因突变引起耐药外，还可能存在其它形式的耐药机制。 对20株铜绿假单胞菌哇诺酮类药物耐药株的舒rA基因PCR产物进行RFLP分析表明，用PcR扩增铜绿假单胞菌酬A基因的哇诺酮耐药决定区，然后用SacH酶切扩增片段，可快速检测名厂A基因第83位氨四川人学博!:学位论文铜绿假单胞耐喳诺酮类药物的分子机制研究基酸密码子发生点突变的铜绿假单胞菌哇诺酮药物耐药株。 用荧光法测定对环丙沙星不同敏感性的铜绿假单胞菌细胞内环丙沙星蓄积量研究表明，多重耐药株细胞内环丙沙星稳定态浓度显著低于敏感株;加入能量抑制剂碳酞氰基一对一氯苯踪，所有菌株细胞内环丙沙星蓄积量增加，但只有多重耐药株细胞内环丙沙星的浓度增加显著，表明多重耐药株具有主动外排作用。 MexAB一OPrM主动外排是导致野生型铜绿假单胞菌对多种抗生素产生耐药性的主要因素。用PCR和DNA测序方法，对MexAB一OPrM外排系统结构基因oprM研究表明，所有菌株的oprM基因未发生突变或缺失。用RT一PCR方法研究oprM基因表达结果显示，只有多重耐药株的oprM基因能在RNA水平上高表达，oprM基因的高表达导致MexAB一OprM的主动外排。 对MexAB一OPrM外排系统的调节基因mexR的研究结果显示，铜绿假单胞菌主动外排多重耐药株PNI和PN16的mexR基因编码第“位氨基酸的碱基发生了单点突变;将含有mexR突变基因的重组质粒pMD 18一丁/mexR转化到了铜绿假单胞菌敏感菌队2中，重组菌PAZ获得了对环丙沙星的部分耐药性。用RT一PCR方法在重组菌队2中扩增出了oprM基因片段。这说明MexAB一OPrM主动外排系统，可能受mexR基因的调控。因此，我们有理由相信，mexR基因将有可能成为筛选抑制主动外排耐药系统药物的分子靶点。 生物膜细菌具有极强的耐药性和抵抗机体免疫系统作用的能力。用绿色荧光蛋白基因(加)标记铜绿假单胞菌敏感株，选用特氟隆作为生物膜形成的附着物，对铜绿假单胞菌舒rA基因突变和MexAB一OPrM主动外排在细菌生物膜耐药中的作用进行研究。结果显示，在生物膜形成的过程中，生物膜细菌在MBC浓度的环丙沙星溶液中4小时的存活四川大学博卜学位论文铜绿假单胞耐哇诺酮类药物的分子机制研究率，呈现出一个与细菌生长曲线相似的规律;无论是敏感株，还是MexA