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肝癌最我国最常见的恶性肿瘤之一,占新发恶性肿瘤9.42%。当前,外科手术切除或消融治疗仍是治疗I a肝癌的首选治疗方法,但由于早期肿瘤发生的隐匿性,导致早期发现、早期诊断及早期治疗肝癌难以实现。对于中晚期肝癌,外科手术切除后5年复发率高达40%-70%,5年生存率低。对于不能外科手术切除的中晚期肝癌,可选择肝动脉栓塞化疗、消融、FOFOX4全身化疗及索拉菲尼分子靶向药物治疗、外放射治疗或125I粒子组织间内放射治疗、免疫治疗等治疗方法。其中化疗是肝癌重要的治疗手段之一,但由于传统的小分子化疗药物的局限性,如化疗药的毒副作用限制了肿瘤治疗的有效剂量,肿瘤干细胞化疗逃逸,加之肿瘤组织微环境内缺氧和酸中毒、间质高压形成,导致药物不能有效渗透至肿瘤内部等原因致使肝癌化疗效果较差,毒副作用较严重。因此,开发一种具有主动靶向性,高效肿瘤细胞杀伤作用,低毒副作用,并具有实时监测药物的分布、代谢和疗效,兼具诊断功能的诊疗一体化载药体系成为当前研究热点之一。基于上述需求,本课题第一章设计和制备了一种具有肝癌细胞药物靶向递送、MRI对比增强、癌细胞微环境可控性药物释放的诊疗一体化多功能杂化介孔二氧化硅纳米粒子 FA-Gd2O3@MSN-DOX。使用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)、扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)、X 射线衍射仪(x-ray diffractometer,XRD)、全自动微孔物理吸附和化学吸附分析仪、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)波谱仪,傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared,FT-IR)、热重分析仪(thermogravimetric analyzer,TGA)、荧光分光度计、粒子分析仪、电感耦合等离子发射光谱仪、双光束UV/Vis分光光度计等多种方法对FA-Gd2O3@MSN-DOX进行了表征。合成的FA-Gd2O3@MSN-DOX为球形,平均粒径约为50nm,纳米粒子比表面积为862.2 m2/g,介孔规则有序,孔直径约为3.8nm,介孔内DOX负载量约为4.2wt%,介孔壁上负载的Gd2O3纳米粒子含量为2.6wt%,在弱酸性溶液中,纳米粒子表面采用LBL方法包覆的多层聚合物TPAMA/PAH降解并释放介孔内携载的抗癌药物DOX,且其释放药物的速度随着pH值的降低而加快。随着DOX的释放,水分子进入介孔内,在介孔壁上磁性Gd2O3纳米粒子的作用下,产生T1WI强化作用。其中,Gd2O3@MSN-NH2弛豫率约为DTPA-Gd的三倍,而包覆多层聚合物膜之后的Gd2O3@MSN弛豫率降低,略低于DTPA-Gd,利用弱酸降解包覆的聚合物后,MRI信号强度逐渐恢复到高值,表现出了良好的pH感应性和T1成像能力。本课题第二章,体外细胞毒性结果显示未载DOX的Gd2O3@MSN及FA-Gd2O3@MSN无论对HepG2细胞及其他癌细胞还是正常细胞均没有毒性,而载 DOX 的 FA-Gd2O3@MSN-DOX 和 Gd2O3@MSN-DOX 纳米粒子组对 HepG2 细胞及其他癌细胞具有明显的细胞毒性,且FA-Gd2O3@MSN-DOX细胞毒性作用较Gd2O3@MSN-DOX更强,但二者对正常细胞的毒性均较小,提示该体系具有较小的全身毒性从而有益于其生物医学应用。Gd2O3@MSN和FA-Gd2O3@MSN-DOX对 HepG2 细胞、Hela 细胞、A549 细胞半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分别约为:52/3 0μg/mL、11/4μg/mL、119/93 μg/mL。该结果的差异可能是由于不同的肿瘤细胞摄取纳米粒子效率不同,FA-Gd2O3@MSN-DOX由于癌细胞叶酸受体的介导作用表现出更高的细胞内化性能。细胞凋亡实验进一步证实了不载DOX的Gd2O3@MSN及FA-Gd2O3@MSN组细胞凋亡率与对照组比较在纳米粒子与细胞孵育12h、24h及48h各个时间点均无显著差异(P<0.05)。载 DOX 的 FA-Gd2O3@MSN-DOX 和 Gd2O3@MSN-DOX随纳米粒子与肿瘤细胞孵育时间的延长肿瘤细胞凋亡率逐渐增加,在共孵育48小时后 Gd2O3@MSN-DOX 组平均凋亡率为(29.3133±0.67026)%,FA-Gd2O3@MSN-DOX组平均凋亡率为(42.9100±6.22820)%,凋亡率明显高于对照组及不载DOX的Gd2O3@MSN和FA-Gd2O3@MSN组(P<0.01)。激光共聚焦显微镜证实了 FA-Gd2O3@MSN-DOX及Gd2O3@MSN-DOX跨膜进入细胞后主要分布于癌细胞的溶酶体内。随着纳米粒子与癌细胞孵育时间的延长,摄入细胞内的FA-Gd2O3@MSN-DOX或Gd2O3@MSN-DOX在溶酶体内的聚集呈现差异,FA-Gd2O3@MSN-DOX呈持续性增高,Gd2O3@MSN-DOX在前24小时内呈上升趋势,其后呈下降趋势,这归因于前者是叶酸介导的主动靶向进入细胞,后者依靠被动靶向进入细胞,进入细胞内的纳米粒子量主要取决于细胞内外纳米粒子的浓度梯度。进一步观察游离的DOX在细胞内分布可见游离DOX进入细胞后呈弥散分布,可见细胞核内有大量DOX,而不是仅局限于溶酶体内,这归因于小分子的游离DOX主要以扩散的方式跨膜进入细胞。通过激光扫描共聚焦荧光寿命成像,证实了 DOX在细胞内随时间延长可逐渐从纳米粒子内释放出来,从负载状态的长荧光寿命变为游离状态的短荧光寿命,从而发挥肿瘤细胞杀伤作用。通过Western Blot检测在分子水平上证实了 FA-Gd2O3@MSN-DOX可抑制肿瘤细胞自噬,阻断自噬流,从而导致细胞凋亡。细胞电镜从亚细胞形态学上进一步证实FA-Gd2O3@MSN-DOX及Gd2O3@MSN-DOX可抑制肿瘤细胞自噬,阻断自噬流,细胞浆内自噬溶酶体明显增多,增大。另外,体外细胞核磁共振结果显示HepG2细胞分别与不同浓度的FA-Gd2O3@MSN、Gd2O3@MSN和Gd-DTPA孵育48小时后,FA-Gd2O3@MSN组具有最高信噪比(SNR),其次是Gd2O3@MSN组,Gd-DTPA组的信噪比最低。本章结果表明合成的FA-Gd2O3@MSN-DOX对HepG2肝癌细胞具有靶向递送、肿瘤内环境pH感应性释放携载抗癌药物DOX,并具有高效杀伤肿瘤细胞的作用,随着DOX的释放,MRI对比增强效果逐渐增加,具有潜在实时监测药物递送、释放、分布及疗效的功能,充分展示了其具有诊疗一体化的效能。本课题第三章,通过活体动物实验研究了 FA-Gd2O3@MSN-DOX在体内的分布、代谢和清除过程,FA-Gd2O3@MSN-DOX经尾静脉注射后,主要分布于肺部、肝脏和肾脏,随着时间的延长,上述脏器脏器内的DOX荧光信号逐渐减弱,注射72小时后除肺部残留少许DOX荧光信号,肝脏和肾脏的DOX荧光信号基本消失。在注射药物后的0.5h和6h胃肠道内的DOX荧光信号明显增加,其后荧光信号维持在较高水平。脾脏和心脏内未见明显荧光信号。值得注意的是在注射药物12h时,胆囊内可见较强的荧光信号。这一结果提示FA-Gd2O3@MSN-DOX经静脉注射后,主要的代谢途径为肾脏和肝脏单核吞噬细胞系统以及胆汁-消化道途径。病理学上体内主要脏器也没有的组织结构的破坏。生物安全性实验结果表明经静脉注射FA-Gd2O3@MSN-DOX对血常规和肝肾功能没有明显影响,显示了良好的生物相容性和生物安全性。经瘤内给药,FA-Gd2O3@MSN-DOX可在瘤体内弥散,并最终杀伤肝癌细胞,且FA-Gd2O3@MSN-DOX效果高于Gd2O3@MSN-DOX,这一结果表明,FA-Gd2O3@MSN-DOX具有良好的肝癌细胞主动靶向性和良好的肿瘤细胞杀伤作用。MRI扫描显示FA-Gd2O3@MSN在瘤内注射1周内,T1WI信号强度逐渐增加,表明其具有良好的瘤组织内弥散作用和靶向作用,可用于检测负载药物的分布、释放和实时监测疗效。总之,本课题成功合成了肿瘤微环境响应性FA-Gd2O3@MSN-DOX诊疗一体化体系,可主动靶向肝癌细胞,并利用癌细胞溶酶体弱酸环境降解包覆的pH响应聚合物,释放负载的DOX杀伤肿瘤细胞,水分子进入介孔内,引起MRI T1WI强化作用,可用于实时监测携载药物在肿瘤病灶内的分布、代谢和疗效,兼具MRI对比增强作用。