本文针对目前国内外蛋白酶解法生产功能多肽经典的“小分子制备小分子吸收”的设计准则存在的酶解时间长、生产成本高等不足,创新性地提出“大分子制备小分子吸收”的新思路,即在体外对蛋白原料进行短时间的适度酶解获得大分子多肽,口服后在体内进一步经过胃肠道的消化,最终形成小分子多肽后而被吸收。在这一思路下,本文以大米降血压肽的制备为例,创建了大米蛋白的超声辅助酶法提取,大分子大米多肽酶解条件的筛选及体系的建立,酶解反应的超声强化,酶解反应过程的原位实时监测等关键技术,并最终实现了大分子大米降血压肽制备的目标。本文在理论和方法方面,旨在为大分子多肽的制备构建了一套全新的技术方法。主要的研究结论如下:(1)原料蛋白超声辅助酶解提取方法:为了提高大米蛋白的提取率,建立在低碱浓度条件下采用超声辅助淀粉降解提取大米蛋白的方法。超声辅助淀粉降解法可显著提高大米蛋白的提取率,其中在物料浓度80 g/L、提取温度50℃、α-淀粉酶的加酶量1%、p H 7.8、超声工作模式20/35 k Hz顺序双频、超声功率密度100 W/L和超声时间3 h辅助提取的条件下,大米蛋白提取率最高,为89.58%(蛋白得率为92.99%,蛋白纯度为96.33%)。超声辅助淀粉降解法与低碱浓度(p H 7.8)相比,大米蛋白的提取率提高了1.47倍,与淀粉降解法(p H 7.8)相比,大米蛋白的提取率提高了74.82%,与高碱浓度(p H 9.0)相比,大米蛋白的提取率提高了66.88%,与超声辅助碱(p H 9.0)提取相比,大米蛋白提取率提高了18.73%。通过蛋白和淀粉含量、傅里叶红外光谱信息、氨基酸分析及SDSPAGE电泳结果可知,超声辅助淀粉降解法可通过破坏淀粉-蛋白聚合物结构,进而提高蛋白的提取率。超声辅助淀粉降解法提取的大米蛋白的溶解性、乳化性和起泡能力均显著增加,这些性能的改变可提高后续试验的蛋白酶解效果。(2)大分子大米降血压肽制备体系:为了利用胃肠消化功能,同时防止多肽的过度酶解,采用“体外酶解+体内消化”的方法,将大米蛋白在体外适度酶解,使得其在体内消化后的大米多肽的降血压活性达到最大值。通过蛋白酶的筛选试验得出,中性蛋白酶酶解大米蛋白,在蛋白水解度为8%时,酶解产物经过胃肠模拟消化后的ACE抑制活性(体外降血压活性指标)最高。不同酶解参数均未显著改变蛋白酶解产物及其胃肠模拟消化产物的ACE抑制活性(p>0.05),但对大米蛋白水解度达到8%时的酶解时间具有显著影响(p<0.05)。因此以大米蛋白水解度达到8%时的酶解时间作为响应值,设计四因素三水平响应面试验,利用软件预测出酶解时间最短的酶解条件:物料浓度为46.24 g/L,加酶量为7.94%,p H为7.11和酶解温度为53.46℃,预测出在此条件下的酶解时间为37.10min,在此条件下通过试验验证酶解时间为36.82 min,说明软件分析的回归模型具有良好的预测效果,在此基础上测定酶解产物经过胃肠模拟消化后的产物活性为61.74%。由酶解物及其胃肠模拟消化产物的多肽含量、ACE抑制活性及相对分子量分布结果可知,大分子大米多肽(蛋白水解度8%)经过胃肠消化之后的ACE抑制活性明显高于小分子大米多肽(蛋白水解度16%)经过胃肠消化之后的ACE抑制活性,且消化之后可直接吸收的多肽含量(分子量200-500 Da之间)明显增多,氨基酸含量减少。大分子大米多肽的制备体系在缩短酶解时间的同时,增加了胃肠消化以后产物的活性,这些结果验证了大分子大米多肽理论的正确性及制备体系的合理性,具有良好的应用价值。同时,将分子量大于1000 Da的比例高于90%,或者分子量大于3000 Da的比例高于80%的大米蛋白酶解物定义为具有ACE抑制活性的大分子大米多肽。(3)超声强化蛋白酶解制备大分子大米多肽技术:为了突破目前采用超声辅助酶解反应中超声波设备相对落后、工作模式单一等问题,本文采用了本课题组研制的五种新型超声波设备强化蛋白酶解反应制备大分子大米多肽。结果表明,所有的超声预处理对大米蛋白酶解产物及其胃肠模拟消化产物的ACE抑制活性均有显著影响,其中在物料浓度为46.24 g/L,温度为53.46℃,超声工作模式为20/40 k Hz双频S型超声,超声功率密度为125 W/L,超声时间为20 min条件下,大米蛋白酶解产物经过胃肠模拟消化后的ACE抑制活性最高,为71.38%,较未超声组相比提高了55.72%,较传统的超声波清洗器提高了43.54%。但在本试验设定的范围内,不同的超声功率密度和超声时间预处理大米蛋白均未显著(p>0.05)降低大米蛋白的酶解时间。通过大米蛋白的结构分析可知,超声预处理可以通过降低大米蛋白的α-螺旋和β-转角的含量,增加β-折叠和无规则卷曲含量,同时通过增加蛋白的疏水性及降低二硫键的含量影响蛋白的酶解效果,从而提高酶解产物经过胃肠模拟消化后的ACE抑制活性。根据具有ACE抑制活性的大分子大米多肽的定义可知,超声预处理后,大米蛋白的酶解产物仍为具有ACE抑制活性的大分子大米多肽。(4)大分子大米多肽制备过程的原位实时监测:是否能实现多肽制备过程的智能化,关键在于对过程目标参数的实时获取,为此利用探头式拉曼光谱技术,构建可以精确预测目标产物的数学模型。通过Si-PLS模型的建立可知,大米蛋白水解度的最佳联合区间为418.427-600.406、1276.204-1426.07、1854.467-1984.029和2464.368-2571.622 cm-1。酶解产物胃肠模拟消化后的ACE抑制率的最佳联合区间为214.423-398.846,742.877-903.002,1063.515-1212.354和1503.061-1636.945 cm-1。在筛选的最佳子区间条件下,对大米蛋白水解度和酶解产物经过胃肠模拟消化后的ACE抑制率建立Si-PLS定量模型。大米蛋白水解度的校正模型r值为0.9048,RMSECV为1.09%,预测模型r值为0.8389,RMSEP为1.45%。酶解产物经过胃肠模拟消化后的ACE抑制率的校正模型r值为0.9733,RMSECV为3.42%,预测模型的r值为0.9381,RMSEP为5.57%。通过拉曼光谱与酶解过程重要参数之间数学模型的建立,实现了大分子大米降血压肽制备过程的原位实时监测。(5)大分子大米多肽的安全性及其消化吸收和降血压效果:为了评价大分子大米多肽的安全性、消化吸收和降血压效果,进行了小鼠急性经口毒性试验、SD大鼠消化吸收试验和原发性高血压大鼠灌胃试验。通过急性毒性试验结果可知,大分子大米多肽的最大经口毒性试验饲喂剂量大于15000 mg/kg,说明大分子大米多肽属于无毒级。灌胃大分子大米多肽显著提高SD大鼠血液中的多肽含量增幅,为4.78μg/m L(与小分子大米多肽相比增加了15.74%)。通过长期灌胃SHR试验结果可知,灌胃卡托普利组的收缩压降幅45 mm Hg(血压值为156mm Hg),舒张压降幅25 mm Hg(血压为125 mm Hg),高剂量大分子大米多肽组的收缩压降幅33 mm Hg(血压值为165 mm Hg),舒张压降幅21 mm Hg(血压值为138 mm Hg)。虽然卡托普利的降血压效果优于大分子大米多肽的降血压效果,但大分子大米降血压肽仍具有显著的降血压作用,且效果优于小分子大米多肽,此结果再一次验证大分子大米多肽理论的正确性及制备体系的合理性。通过脏器的ACE活性以及血清生化指标的测定结果可知,大分子大米多肽可通过抑制肺和主动脉的ACE活性,以及影响信号因子中的一氧化氮、一氧化氮合成酶、肾素和血管紧张素II的含量降低血压。与卡托普利不同的是,多肽对肌酸激酶同工酶和乳酸脱氢酶同工酶的活性均无影响,表明其具有较高的安全性。