神经系统损伤严重威胁患者生活质量和生命安全。目前没有比较有效的用于治疗神经系统损伤的药物,而传统的自体神经组织移植治疗神经系统损伤的疗法,因供体来源有限,神经瘤的产生,以及供体神经束和受体神经束的不匹配而不能广泛地应用。利用组织工程策略,将生物支架材料与种子细胞复合,体外再造功能性的神经组织,然后移植到病变部位修复或者替换损伤的神经组织,有望解决上述问题。组织工程的关键是支架材料。I型胶原是细胞外基质的主要成分,因其具有低免疫原性,良好的生物相容性且安全无毒而广泛应用于组织工程支架材料。Matrigel也是细胞外基质成分,将一定比例的Matrigel掺入I型胶原,可以改善胶原的物理特性,使其疏松多孔,能够更好的作为组织工程支架材料,为细胞提供附着点,且便于细胞在三维孔径中的生长延展,利于氧气、营养物质和代谢废物等的运输,且Matrigel中的一些组分如层连接蛋白、IV型胶原、巢蛋白等能够为细胞生长提供营养作用。本论文首先分离了胎鼠神经元和新生鼠星形胶质细胞,以此两种细胞为种子细胞,胶原/Matrigel为支架材料,体外成功构建了神经组织。然后,我们分离了胎鼠NSCs,以NSCs为种子细胞,胶原或者胶原/Matrigel为支架材料,考查Matrigel掺入胶原后对体外再造的神经组织中细胞存活、增殖及分化的影响。在此基础上,用不同比例的胶原/Matrigel为支架材料,考查胶原中不同比例的Matrigel对体外再造神经组织中细胞的存活、增殖和分化的影响。本论文主要包括以下研究内容:第一章:神经元和星形胶质细胞的分离培养与鉴定第一节:神经元的分离培养与鉴定我们从胎鼠大脑皮层分离细胞并用培养基选择性培养,MAP2免疫荧光染色对其进行鉴定,为下一步的体外再造三维神经组织提供种子细胞。相差显微镜下观察,细胞接种4h即开始贴壁,培养一周左右,胞体发出的突起交织成网状, MAP2免疫荧光染色呈阳性,说明我们分离培养的细胞为神经元。第二节:星形胶质细胞的分离培养与鉴定我们从新生大鼠分离培养神经胶质细胞,体外纯化鉴定得到星形胶质细胞,为下一步的体外再造三维神经组织提供种子细胞。结果表明,我们原代分离的细胞经差速度贴壁培养和传代培养后,光镜下可见,细胞胞体较大,分支少,突起宽而扁。GFAP免疫荧光染色呈阳性,证明我们分离的细胞是星形胶质细胞。第二章:NSCs的分离培养与鉴定我们首先从胎鼠大脑皮层分离得到细胞,用NSCs培养基选择性培养,得到克隆样生长的细胞并纯化,然后我们通过NSCs特异性标志物Nestin对其进行鉴定,并掺入溴脱氧尿嘧啶核苷酸(BrdU)检测其增殖特性,接着用免疫荧光的方法检测了其向星形胶质细胞、神经元以及少突胶质细胞分化的能力。结果表明,我们分离纯化的细胞呈球形克隆样生长,BrdU掺入及Nestin免疫荧光染色呈阳性,经胎牛血清(FBS)诱导可得到GFAP阳性细胞、MAP2阳性细胞及Oligo2阳性细胞。综上所述,我们分离的细胞Nestin染色阳性,且具有增殖能力和向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的能力,为NSCs。第三章:以神经元和星形胶质细胞为种子细胞的体外神经组织三维再造研究本部分研究中,借鉴我室在心肌组织工程再造研究方面既有的研究平台和技术体系,结合相关文献在神经组织工程方面的报道,我们利用液态Ⅰ型胶原/Matrigel为支架材料,神经元和星形胶质细胞为种子细胞,体外再造神经组织,并用Live/Dead活性染色检测了工程化神经组织内细胞的存活情况。结果表明,体外构建的工程化神经组织,当细胞接种密度为7.5×106个/mL时,工程化神经组织中的细胞存活率较高,达到86%,且由神经元胞体发出的突起形成了丰富的神经网络。第四章:以NSCs为种子细胞的体外神经组织三维再造研究第一节:Matrigel胶对神经组织体外再造影响的实验研究本实验采用鼠尾I型胶原,以NSCs为种子细胞,以胶原或者胶原/Matrigel作为支架材料,体外再造三维神经组织,并比较两种再造神经组织中细胞的存活、增殖以及分化成星形胶质细胞、神经元以及少突胶质细胞的情况。扫描电镜结果显示,胶原表面多浅孔,隐约可见许多交织的胶原纤维。而胶原中掺入Matrigel后明显改变了胶原的表面结构,复合物表面变得疏松,孔径变大,胶原纤维交织成网状结构。复合物培养1d、3d、7d的Live/Dead染色结果显示,随着时间的延长,胶原组和胶原/Matrigel组中细胞存活率均降低。且在各个时间点,胶原/Matrigel组中细胞存活率均高于胶原组。NSCs接种至胶原以及胶原/Matrigel复合物24h后,胶原组和胶原/Matrigel组中NSCs均已开始分化,但是胶原/Matrigel组中的细胞突起长度明显大于胶原组,随着时间的延长,胶原组和胶原/Matrigel组中细胞的突起均变长,细胞间交织形成网状结构,但是胶原/Matrigel组中细胞突起形成的网状结构更致密。胶原组以及胶原/Matrigel组中第3d和第7d的DNA含量结果显示,两组DNA含量均有所增加,但在各个时间点,两组间DNA含量没有统计学差异。NSCs在胶原及胶原/Matrigel复合物中培养14d后,免疫荧光染色,均可见GFAP阳性星形胶质细胞,MAP2阳性神经元以及Oligo2阳性少突胶质细胞。第二节:不同比例Matrigel胶对神经组织体外再造影响的实验研究我们向胶原中掺入不同比例Matrigel胶,并用扫描电镜观察其表面结构,然后以NSCs为种子细胞,以不同比例胶原/Matrigel作为支架材料,体外再造三维神经组织,并比较含不同比例Matrigel的三维神经组织中NSCs的存活、增殖和分化成星形胶质细胞、神经元以及少突胶质细胞的情况。扫描电镜结果显示,不同比例胶原/Matrigel表面均多孔,胶原纤维交织成网状结构。光镜下可见,NSCs在不同比例胶原/Matrigel复合物中培养24h已经伸出突起,且随着培养时间的延长,各组中细胞突起均变长且交织成网状,其中胶原+60% Matrigel组中细胞突起最长。复合物Live/Dead染色结果显示,随着培养时间增加,各组中细胞存活率基本呈降低的趋势,各组细胞24h存活率均在99%左右,各组细胞3d存活率均在89%左右,各组细胞7d存活率均在88%左右。统计学结果显示,不同比例胶原/Matrigel组中细胞培养24h、3d、7d后的存活率没有统计学差异。复合物培养3d和7d的DNA含量结果显示,各组复合物中DNA含量均有所增加,复合物培养3d时,胶原+15% Matrigel组与胶原+30% Matrigel组,胶原+30% Matrigel组与胶原+60% Matrigel组的DNA含量有统计学差异,其余各组间没有统计学差异,复合物培养7d时,各组中DNA含量均没有统计学差异。复合物培养14d后,免疫荧光染色,均可见呈GFAP阳性的星形胶质细胞,MAP2阳性的神经元以及Oligo2阳性的少突胶质细胞。其中,胶原+15% Matrigel组中NSCs向神经元分化的比例为32.6%,其余各组均小于30%;胶原+15% Matrigel组中NSCs向少突胶质细胞分化的比例为5.6%,其余各组在10%左右;胶原+60% Matrigel组中NSCs向星形胶质细胞分化的比例达到54.9%。综上所述,本研究首先用神经元和星形胶质细胞作为种子细胞,胶原/Matrigel作为支架材料,体外成功再造神经组织,该组织内细胞存活良好且交织形成丰富的神经网络。然后以神经干细胞为种子细胞,胶原/Matrigel为支架材料,体外再造神经组织,并考察了再造组织中细胞存活、增殖以及其向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的分化情况。本研究为神经系统的损伤修复、神经系统退行性疾病的治疗、神经系统疾病损伤以及神经系统药物的药效学评价模型研究奠定了基础。